花生红衣多酚-锌配合物的制备及其抗氧化性质

王翠莲，武晓炜，阳嘉，姜欣伶，王越，李海燕*

鲁东大学食品工程学院（烟台 264025）

花生红衣是花生加工的副产物，我国每年在花生加工过程中产生的花生红衣总量近千吨，资源丰富。花生红衣除少量用作中药外，大多数被当作废弃材料制成动物饲料，经济价值非常低[1]。花生红衣中含有丰富的多酚类物质，这些多酚类物质具有很好的生物活性，如降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等[2-4]。

多酚分子结构中含有多个酚羟基，可以发生醚化、苷化等反应，能与金属离子发生螯合作用。有研究表明，多酚成分与金属离子结合后，其生物活性得到显著增加，甚至可以产生新的药理作用[5-7]。多酚螯合锌与氨基酸螯合锌类似，分子量较小，较易通过肠壁从而被人体吸收，且不受外界环境pH影响，即使在胃部pH较低条件下，依然能稳定存在而不被分解，最终被人体所利用吸收，具有极高生物效价[8-10]。花生红衣多酚与金属离子的螯合作用还未见相关报道，花生红衣多酚与金属离子的配合物可能同时兼有多酚与金属离子的生物活性，从而使得花生红衣多酚的应用更加广泛。

试验利用超声波辅助法乙醇提取花生红衣多酚，将多酚与Zn2+进行配位，制备花生红衣多酚-Zn配合物（PSP-Zn），并研究其抗氧化性质。为花生红衣多酚更好应用于医药、食品等行业提供理论支持[6-7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生红衣（山东鲁花集团）；DPPH（分析纯，上海如吉生物科技发展有限公司）；硫酸锌（分析纯，天津市广成化学试剂有限公司）；大孔吸附树脂AB-8（分析纯，天津浩聚树脂科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

低速大容量离心机（LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂）；旋转蒸发器（RE-52B，上海亚荣生化仪器厂）；可见分光光度计（721G，上海圣科仪器有限公司）。

1.3 花生红衣多酚的提取、纯化及含量测定

1.3.1 花生红衣多酚的提取

花生红衣多酚提取工艺参考刘晓艳等[11]和任虹等[12]的研究。具体操作为：将花生红衣粉末过40目筛备用。准确称取1.0 g花生红衣粉末，放于烧杯中，按料液比1∶90（g/mL）加入体积分数56%的乙醇试剂，在超声功率240 W条件下超声25 min进行多酚提取，提取结束后离心提取液，去掉残渣，取上清液进行旋蒸，除去提取液中的乙醇。将旋蒸后的提取液转移于100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度线，备用。

1.3.2 花生红衣多酚的纯化

取40 mL活化后的湿树脂装柱，将多酚粗提液进行上样，充分吸附3 h，用2倍树脂体积的蒸馏水以1.5 mL/min流速洗去杂质，之后分别用20%、60%的乙醇溶液以1.5 mL/min的流速进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋蒸除去乙醇后，真空干燥得到花生红衣多酚（PSP），经测定PSP多酚含量达80%。

1.3.3 花生红衣多酚含量的测定

参照酒石酸亚铁比色法。量取1 mL提取液于25 mL容量瓶中，加入4 mL与提取时相同浓度的乙醇溶液，摇匀后加入5 mL酒石酸铁溶液，摇匀。用pH 7.5的缓冲液定容，充分混合，静置30 min显色后，测其在波长540 nm处的吸光度。

1.4 PSP-Zn的制备及螯合率的测定

1.4.1 PSP-Zn的制备

按照一定的质量比加入与花生红衣多酚质量浓度（1.2 mg/mL）相同的ZnSO4溶液，用玻璃棒充分搅拌使其完全反应。用柠檬酸和碳酸氢钠将溶液调至一定的pH，在一定水浴温度下螯合30 min后，在4 000 r/min的离心条件下离心10 min，除去沉淀物，收集上清液即为PSP-Zn[13-14]。

1.4.2 螯合率的测定

参照EDTA配位滴定法[15]滴定螯合物中的金属元素。取5 mL质量浓度为1.2 mg/mL的PSP-Zn溶液，定容到25 mL容量瓶中，摇匀。加入3滴二甲酸橙指示剂，用0.02 mol/L EDTA溶液滴定，记下所消耗的溶液体积V0（mL）；另取相同体积的PSP-Zn溶液，加10 mL乙醇，水浴温热充分搅拌后用蒸馏水定容至25 mL，摇匀。加3滴二甲酸橙指示剂，用0.02 mol/L EDTA溶液滴定，记下所消耗的溶液体积V1（mL）。通过式（1）计算出相应的金属离子螯合率。

1.5 花生红衣多酚螯合工艺的单因素试验

1.5.1 反应温度对PSP-Zn制备的影响

量取5组10 mL质量浓度为1.2 mg/mL的PSP溶液，分别加入30 mL质量浓度为1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，调至pH 7.0。分别将5组螯合的反应体系置于30，40，50，60和70℃恒温水浴锅中水浴30 min，在4 000 r/min条件下离心10 min，去除沉淀收集上清液。测定金属螯合率。每组做3组平行试验。

1.5.2 pH对PSP-Zn制备的影响

量取5组10 mL质量浓度为1.2 mg/mL的PSP溶液，分别加入30 mL质量浓度为1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，分别调至pH 4.0，5.0，6.0，7.0和8.0，在40℃水浴条件下螯合30 min，以4 000 r/min离心10 min，去除沉淀收集上清液。测定金属螯合率。每组做3组平行试验。

1.5.3 质量比对PSP-Zn制备的影响

量取5组10 mL质量浓度为1.2 mg/mL的PSP溶液，分别按质量比2∶1，3∶1，4∶1，5∶1和6∶1加入质量浓度为1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，调节至pH 6.0，在40℃下螯合30 min，在4 000 r/min条件下离心10 min，去除沉淀收集上清液。测定金属螯合率。每组做3组平行试验。

1.6 响应面优化PSP-Zn的制备条件

根据PSP-Zn制备的单因素试验结果，选取反应温度、pH、质量比3个因素作为自变量，以螯合率为响应值，根据Box-Behnken设计原理，做三因素三水平响应面分析试验，以研究所选的3个因素对花生红衣多酚与金属离子螯合的综合影响。响应面因素水平的设计情况如表1。

表1 PSP-Zn制备工艺响应面因素水平

1.7 抗氧化能力的测定

1.7.1 清除DPPH·能力的测定

用95%乙醇配制1×10-4mol/L的DPPH溶液备用。配制与相同浓度的PSP、PSP-Zn、VC、VE溶液。分别量取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL样品溶液于试管中，用蒸馏水补至1 mL，加入1×10-4mol/L的DPPH溶液3 mL摇匀静置30 min后于517 nm下测吸光度A。用蒸馏水代替样品，其他条件不变，作为对照测吸光度A0，计算清除率[16]。

1.7.2 清除羟自由基能力的测定

分别量取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL PSP、PSPZn、VC、VE溶液于试管中，用蒸馏水补至1 mL，依次加入1 mL浓度为0.15 mol/L FeSO4溶液，1 mL浓度为2 mmol/L水杨酸溶液、1 mL浓度为6 mmol/L的过氧化氢溶液，在37℃下反应1 h，测定510 nm处的吸光度A；用蒸馏水代替上述样液，其他条件不变，测吸光度A0，计算清除率。

2 结果与分析

2.1 反应温度对PSP-Zn制备的影响

反应温度对PSP-Zn制备的影响如图1所示。在一定温度范围内，螯合率随反应温度增加而提高，多酚与Zn2+螯合率在60℃时达到最大，最大值分别为44%。花生红衣多酚与金属的螯合体系温度达到最佳温度后，金属离子的螯合率呈现下降趋势。这可能是由于较高温度破坏多酚与Zn2+之间起螯合作用的化学键，从而使螯合率下降。

图1 温度对PSP-Zn制备的影响

2.2 pH对PSP-Zn制备的影响

由图2可知，在酸性范围内，螯合率随pH升高呈上升趋势，说明酸性条件有利于花生红衣多酚与金属螯合反应进行；反应体系pH 6.0时，多酚与Zn2+的螯合率达到最大值45%。反应体系呈碱性时，多酚与金属离子的螯合率急剧下降。出现这种现象的原因是由于多酚的独特分子结构，它可在电解液中电离出较多的氢离子，使整个反应体系呈现酸性。在碱性环境中，OH-一方面可与氢离子结合，促使平衡反应向右进行，促进更多多酚物质降解；另一方面OH-本身可与Zn2+结合生成沉淀，从而减少多酚与金属离子之间螯合物生成。

图2 pH对PSP-Zn螯合反应的影响

2.3 质量比对PSP-Zn制备的影响

质量比对PSP-Zn的螯合率影响如图3所示。随着金属离子与多酚质量比增大，螯合率呈现逐渐上升趋势，直至达到最佳螯合率后呈现基本保持不变或者下降趋势。多酚与Zn2+的螯合率在质量比3∶1时达到最大值47%，而后变化趋势趋于平稳。

2.4 响应面优化PSP-Zn的制备条件

2.4.1 因素分析及模型建立

花生红衣多酚与Zn2+螯合反应的响应面因素水平的试验结果如表2所示。

利用Design Expert软件对表2数据进行分析后，各试验因子对响应值的影响可用函数表示为Y=49.96- 0.38X1-2.15X2+1.09X3-1.46X12-7.68X22-2.06X32+ 0.82X1X2-0.50X1X3+0.62X2X3。

图3 质量比对PSP-Zn螯合反应的影响

表2 PSP-Zn制备工艺响应面设计及试验结果

对17个试验点的响应值进行回归分析后得到的方差分析表如表3所示。

由表3可知，各因素对多酚与金属的螯合率的影响是不同的，各因素对模型影响程度大小依次为X2＞X3＞X1，即pH影响最大，温度影响最小。

表3 各因素方差分析

2.4.2 响应面分析

由表3可以看出，模型的回归显著性水平小于0.05，说明多酚与锌离子的螯合率与温度、pH、质量比之间的关系显著，而失拟项不显著，说明该方程与实际情况拟合很好。从分析结果可以看出，温度（X1）、pH（X2）及质量比（X3）这3个因素p值只有因素pH的p＜0.01，说明这3个因素对多酚与锌离子的螯合率的影响情况有很大差别，只有pH显著突出。

利用响应面分析法对回归模型进行分析后，因为失拟项显著，从而试验得不到最优工艺条件。所有利用Design Expert软件得出PSP-Zn制备的最优工艺条件：反应温度57.82℃、pH 5.86、质量比3.27∶1，最大螯合率为46.30%。

图4～图6给出利用响应面进行优化时，固定一个因素时，另外2个因素的交互作用对螯合率的影响情况的响应面3D图和等高线图。等高线为圆形时说明两个因素的交互作用不显著，为椭圆形时则说明这2个因素的交互作用显著。温度、pH、质量比这3个因素的交互作用均为显著。

图4 温度与pH的交互作用对PSP-Zn制备的影响

图5 温度与质量比的交互作用对PSP-Zn制备的影响

图6 pH与质量比的交互作用对PSP-Zn制备的影响

2.5 PSP-Zn的抗氧化活性研究

2.5.1 PSP-Zn清除DPPH自由基的活性

DPPH自由基的电子可以与抗氧化剂反应从而降低自由基浓度[17-19]，PSP-Zn中游离羟基数目影响其与DPPH自由基结合的反应速度[20]。花生红衣多酚的提取液（PSP）、VC、VE溶液及PSP-Zn清除DPPH自由基能力如图7所示。

结果表明，所有样液均具有一定清除DPPH自由基能力，且清除能力与自身浓度呈正比，即浓度越高，清除能力越强。质量浓度为1 200 μg/mL时，PSP-Zn对DPPH清除率为84%，明显高于PSP的70%，说明PSP螯合锌离子后清除DPPH能力显著提高。与同浓度VC和VE相比，PSP-Zn的清除DPPH能力也较强。总体上来说，多酚及其金属配合物清除DPPH自由基的能力要高于VE、VC溶液且清除能力较强。

图7 PSP-Zn对DPPH自由基的清除能力

2.5.2 PSP-Zn清除羟自由基的活性

羟自由基几乎能与活细胞内的所有物质发生反应，是危害性很大的活泼性氧自由基之一[21-23]。由图8可知，PSP-Zn清除羟自由基的能力与未螯合前PSP相比有所下降，即二者浓度相同时（1 200 μg/mL），PSP-Zn对羟自由基清除率为23.40%，低于PSP对羟自由基清除率27.71%。同浓度的VC、VE溶液的清除能力要明显高于PSP和PSP-Zn。

图8 PSP-Zn对羟自由基的清除能力

总体上来说，多酚及其多酚金属配合物在清除羟自由基方面的能力要弱于清除DPPH自由基的能力。分析其原因可能是，试验过程采用的是花生红衣多酚粗提物，含有其他杂质，影响金属的配合及产物的抗氧化性质。此外，植物多酚的酚羟基及其多酚分子结构的独特性使其具有抗氧化活性[23-25]，花生红衣中多酚种类及结构也复杂不同，有关其金属配合物结构及抗氧化作用机制还需进一步研究。

3 结论

试验选用山东烟台当地花生加工副产物花生红衣为原料，采取超声波辅助乙醇提取花生红衣多酚。将提取的花生红衣多酚与Zn2+进行配位，制备花生红衣多酚-Zn2+配合物（PSP-Zn），并考察影响金属螯合率的3个因素：温度、pH、质量比。通过单因素和响应面试验确定最佳螯合条件。结果表明，PSP-Zn的最佳制备工艺为：反应温度57.82℃，pH 5.86，质量比4.27∶1。多酚与锌离子的最大螯合率为46.30%。

PSP-Zn的抗氧化性质研究结果显示，在清除DPPH自由基能力方面，PSP-Zn有较强的清除能力，高于同浓度VC、VE溶液，且随着浓度升高，清除能力呈上升趋势；而在清除羟自由基能力方面，PSP和PSP-Zn的清除能力都要低于同浓度VC、VE溶液，且PSP-Zn的清除能力要略低于PSP。PSP-Zn的性质及构效关系还需进一步研究。PSP-Zn的制备和抗氧化性质研究可为新型抗氧化剂的开发提供思路，也为花生红衣的高值化利用提供试验依据。