西双版纳热带雨林植物叶际细菌群落研究

阚 望，许姗姗，杨太源，刘 悦，王连春，李红祥，谭元花，吴德喜，孔宝华*，李成云

(1.云南农业大学 云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201; 2.西双版纳傣族自治州植保植检站，云南 景洪 666100; 3.云南省农业科学院茶叶研究所，云南 景洪 666201; 4.玉溪师范学院，云南 玉溪 653100)

【研究意义】微生物是生态环境中的重要成员，尤其细菌，对生态环境的稳定发挥着十分重要的作用。植物群落的结构、组成和多样性以及植物与微生物群落间的相互作用是由土壤微生物综合调控的，是地球生态系统生产力和多样性的主要驱动者。无论是健康植株还是患病植株，其体内、体表均存在大量细菌[1]。几乎所有植物中都伴随有内生细菌，其与宿主植物在长期共同进化过程中形成密切关系，是植物微生物生态系统的主要成员，它们与植物互作共生，它们的代谢活动及产物可促进宿主植物适应外界各种来自生物、非生物的环境压力，维持生态系统平衡[2]。非人工培养的一些细菌门主要分布在不同植物的叶际环境中。叶际细菌群落具有特定的适应性，并且表现出与宿主植物和细菌群落成员之间的多重关系[3]。因此，研究与合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值[4-5]。【前人研究进展】西双版纳是中国，乃至亚洲生物多样性最为丰富的地区之一[6]。由于热带雨林起源古老，古生物群一直演变延伸至今，保存了一些有研究价值和经济价值的第三纪以前的古生物残余，形成了中国热带生物最密集的地区，拥有大量最珍贵、稀有的生物物种，素有“植物王国”、“天然花园”、“生物物种基因库”的美誉。丰富的植物资源势必孕育丰富的微生物种群。【本研究切入点】关于细菌群落的研究，在水环境的细菌群落与土壤细菌群落方面有相关研究报道[7-10]。但叶际细菌群落研究报道较少，热带雨林叶际细菌群落的研究更少。【拟解决的关键问题】高通量测序研究微生物多样性，相对于传统的生态学方法应用较多，且能在无寄主信息的前提下，更为灵敏、准确地反映出样品中微生物群落的真实情况[11]。应用高通量测序方法研究该区域叶际细菌种群与多样性，对进一步揭示热带雨林的微生物资源及其在该区域生态系统中的功能，探明潜在植物病原致病菌，开发该区域有生物防治前景的有益细菌资源等都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样本的采集

以云南西双版纳热带雨林无病害症状的健康植物为研究对象，2017年5月在景洪市的大渡岗乡、景洪市周边，勐海县的勐养镇、勐宋乡和保塘村，勐腊县的勐仑镇自然保护区和曼搞保护区等7个代表性地点随机采集植物叶片样本，每份样品约200 g，低温保鲜带回实验室，用锡箔纸包裹，迅速置于液氮中冷冻，然后转移至-80 ℃下长期保存。记录采样地点的经纬度与海拔。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA 提取、PCR 扩增及高通量测序 用CTAB方法提取样品总DNA，步骤如下：将植物组织洗干净，用75 %的酒精表面消毒4～5 min，用去离子水冲洗3次；将样品放在研钵中加入液氮捣碎，迅速转入1.5 mL离心管中，应用CTAB方法提取DNA。目前，微生物多样性研究主要是在编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的。细菌主要是基于16S区，16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的DNA序列。提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。高通量测序(如Illumina HiSeq等测序平台)得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序(Reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

1.2.2 数据分析 对原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列(Tags)，将优化序列进行聚类，划分OTUs，并根据OTUs的序列组成得到其物种分类。基于OTUs分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图、物种聚类热图、属分类学水平系统进化发生树及分类学树状图。通过Alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，统计各样品在97 %相似度水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指数，绘制样品稀释曲线及等级丰度曲线。通过 Beta多样性分析比较不同样品在物种多样性方面(群落组成及结构)存在的差异。根据距离矩阵获得相应距离下的样品层次聚类(UPGMA)树、NMDS分析、样品聚类热图及样品PCA、PCoA图(有分组信息)、基于多种距离的箱线图等。通过组间差异显著性分析在不同组间寻找具有统计学差异的Biomarker。

2 结果与分析

2.1 样本OTUs

对西双版纳热带雨林7个采样点的39个植物样品测序，共获得 2 720 883对 Reads，双端 Reads 拼接、过滤后共产生2 368 669条Clean tags，平均每个样品产生60 735条 Clean tags，测定的细菌序列分析97 %以上同源的为一个OTU，分析发现细菌OTUs数量在31～818，样本间存在差别(表1)。ACE指数在99.3484～904.9273，Shannon指数在0.120～5.3132，文库覆盖率都在0.99以上。说明测得的OTU能基本反映所研究的样品细菌的群落组成。选择分析曼搞保护区与景洪市大渡岗乡两个代表性地点的木本与草本OTU。从图1A可知，曼搞保护区A01、A03、A06木本植物样本细菌OTUs分别是48、135、794，各个样本OTUs不同，多样性存在较大差别。检测到共有OTUs 8种。从图1B可知景洪市大渡岗乡木本植物A33、A38、A39分别检测到细菌OTUs 165、199、778，样本之间OTUs差别较大，多样性存在明显差别。重叠检测到共有OTUs为19。从图1C可知曼搞保护区草本植物从A04、A08、A10，样本分别检测到细菌OTUs分别为112、52、63，不同样本OTUs明显不同，显示细菌多样性不同。这些样本的细菌OTUs具有相互重叠，共有细菌OTUs有8种。从图1D可知，从景洪市大渡岗乡草本植物A32、A36、A37分别检测到细菌OTUs为102、144、308。样本之间细菌OTUs差别极大，多样性存在明显差别。重叠检测到共有OTUs数量为37。

A：曼搞保护区木本植物检测到细菌OTUs；B：景洪市大渡岗乡木本植物检测到细菌OTUs；C：曼搞保护区草本植物检测到细菌OTUs；D：景洪市大渡岗乡草本植物检测到细菌OTUsA: The OTUs of bacteria were detected in woody plants in mangao nature reserve. B: The OTUs of bacteria were detected in woody plants in dadugang Township, Jinghong City. C: The OTUs of bacteria were detected in herbaceous plants in mangao nature reserve. D: The OTUs of bacteria were detected in herbaceous plants in dadugang Township, Jinghong City图1 西双版纳热带雨林2个地点草本、木本植物细菌OTUs韦恩图Fig.1 The Venn diagram of the OTUs ofbacterium from herbaceous and woody plants in two sites of Xishuangbanna tropical rainforest

对西双版纳热带雨林7个地点的木本、草本植物检测到的细菌OTUs进行分析(图2)，图2A木本植物所测得的细菌OTUs，A04、A08、A10等23个样品共同OTUs为4种。图2B草本植物所测得的细菌OUTs，A01、A03、A06等16个样品共同OTUs为5种。草本样本细菌共有的OTUs较木本植物细菌共有的OTUs相差不大。木本植物细菌样本之间的OTUs差别相对较草本植物小。

2.2 西双版纳热带雨林植物叶部检测到的细菌门、纲、目与属

在西双版纳热带雨林，在门(phylum)水平上主要检测到Cyanobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes，此外，还有未归类细菌门。在纲(class)水平上高频检测到Alphaproteobacteria(相对丰富度43 %)、Bacteroidia(相对丰富度34 %)、Bacilli(相对丰富度13 %)、Clostridia(相对丰富度15 %)及未归类细菌纲。在目(order)水平上主要检测到Bacteroidales、Clostridiales、Lactobacillales、Rhizobiales、Sphingomonadales及未归类细菌目。在属种水平上主要检测到Lactobacillus(相对丰富度12 %)、Sphingomonas(相对丰富度3 %)、Methylobacterium(相对丰富度5 %)。其他细菌属检出相对丰富度较低。此外，还检测到未归类真菌及其他。

A：西双版纳热带雨林7个采样地点所有木本植物所测得的细菌OTUs;B：西双版纳热带雨林7个采样地点所有草本植物所测得的细菌OTUsA: the bacterial OTUs of all woody plants in seven sampling sites of Xishuangbanna tropical rainforest. B: the bacterial OTUs of all herbaceous plants in seven sampling sites of Xishuangbanna tropical rainforest图2 西双版纳热带雨林草本、木本植物细菌的OTUs韦恩图Fig.2 The venn diagram of the OTUs of bacterium from the herbaceous and woody plants in Xishuangbanna tropical rainforest

图3 纲(class)水平上检出细菌物种Fig.3 The bacterium classes distribution at class level

2.3 主要叶际细菌属群地理与植物分布

分析7个自然保护区叶部细菌检测出的属种，发现7个调查点高频检出的细菌属种存在差别。 列出2个地点的代表性细菌(表1)，其中Methylobacterium、Acinetobacte、Pseudomonas、Sphingomonas分布最为普遍，Pantoea、Aureimonas，Lactobacillus分布普遍，其他细菌属Geobacter、Exiguobacterium、Nocardioides、Hymenobacter、Escherichia-Shigella、Pseudarthrobacter、Comamonas、Vogesella、Massilia与Aeromonas有局部分布。此外，在7个调查点均检测到其他细菌。

分析检测到的细菌属的分布(表1)，在木本植物上，检测出Escherichia-Shigella、Sphingomonas、Pantoea等植物致病菌；同时检测到有益菌Lactobacillus、Acinetobacter、Methylobacterium、Pseudonocardia、Alloprevotella、Bacillus、Microbacterium、Aureimonas等；还检测到已经报道的其他细菌：Chroococcidiopsis、Nocardioides、Massilia、Hymenobacter等。在草本植物上检测到植物致病菌有Sphingomonas、Haemophilus、Pantoea等；有益菌有Methylobacterium、Streptococcus、Pseudomonas、Lactobacillus、Acinetobacter、Microbacterium、Aureimonas、Desulfovibrio等；已报道的细菌有Amnibacterium、Geobacter、Actinomycetospora、Pseudarthrobacter、Psychromona、Quadrisphaeras、Exiguobacterium，以及未鉴定的细菌Pseudokineococcus。在未鉴定植物上检测到植物致病细菌有Sphingomonas、Pantoea；有益菌有Pseudomonas、Lactobacillus、Acinetobacter、Aureimonas、Desulfovibrio；生态环境中报道的细菌Hymenobacter、Quadrisphaera等，以及未鉴定的细菌Pseudokineococcus。

分析检测到的主要细菌的植物分布，显示每个植物具有独特的叶部细菌种类。其中Methylobacterium、Acinetobacte分布最广，Pseudomonas、Sphingomonas次之，以上种类在大部分木本、草本与未鉴定植物中检测到；Geobacter、Exiguobacterium、Nocardioides、Hymenobacter、Escherichia-Shigella、Pseudarthrobacter、Comamonas、Vogesella、Massilia与Aeromonas等细菌，寄主分布较窄，其中有的细菌种类只在1种植物1个采样调查点检测到。

表1 西双版纳热带雨林2个地点检出的主要细菌的植物分布Table 1 Plant distribution of the main bacteria genera detected at two sites of Xishuangbanna

续表1 Continued table 1

注：*表示细菌在环境中有报道；●表示致病菌；+表示有益菌；×表示未知细菌。

Note: * indicates that bacteria have been reported; ● is pathogenic bacteria; + is beneficial bacteria; × is unknown bacteria.

3 讨 论

在检测到的细菌属种中，分析其居住范围和分布关系，以Methylobacterium、Acinetobacte分布最为广泛，Pseudomonas、Sphingomonas次之，Pantoea、Aureimonas与Lactobacillus分布普遍。局部分布的细菌有Geobacter、Exiguobacterium、Nocardioides、Hymenobacter、Escherichia-Shigella、Pseudarthrobacter、Comamonas、Vogesella、Massilia与Aeromonas。此外，在所有地点均检测到其他细菌。检测的细菌中致病菌有4种，有益菌有9种，其他细菌5种。据报道，Methylobacterium为有益菌[12]，促进植物生长。Acinetobacte为内生细菌[13]，Sphingomonas[14]、Pantoea[15]、Escherichia-Shigella[16]等为致病菌，Lactobacillus为益生菌[17]，Pseudonocardia为有益菌[18]。热带雨林生态环境相对稳定，这些潜在植物病原菌与农田生态环境的致病细菌的致病性差别，如何从热带雨林演化成农田强致病菌值得今后深入研究。研究发现的有益细菌，值得深入研究开发利用。此外，研究发现大量未归类与未知细菌，说明西双版纳热带雨林叶际细菌研究很少，深入研究能够丰富分类细菌学与细菌功能研究，揭示热带雨林生物多样性的意义。

4 结 论

选取2个代表性地点的木本、草本检测到细菌的OTUs，发现草本植物中检测到的细菌OTUs普遍比木本植物多，细菌多样性更丰富。西双版纳曼搞保护区细菌OTUs变化幅度较大，草本植物检测的除了共同重叠的OTUs之外木本与草本样本来源的细菌具有独特的OTUs。草本植物比木本植物更容易成为农业生态环境病原的原始来源地。关于热带雨林细菌的演化，在热带雨林生态稳定性中起着重要作用，值得深入研究。