香附水提液抑制百草枯致A549细胞株中毒反应的实验研究

王翠香 刘春浩 于梦娟 王 静 尹晓琳，*

(1.石家庄理工职业学院，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学，河北 石家庄 050000)

0 引言

百草枯(paraquat，PQ)是一种有效且广泛使用的除草剂。但是，PQ中毒是一种非常严重的临床疾病，致死率高，目前缺乏特效PQ解毒药物[1]。一般来说，人类摄入PQ超过20mg/kg，就会导致死亡。短时间大量摄入PQ，快速导致多器官衰竭和休克，进而死亡。小剂量PQ摄入会在肺部累积，产生大量致肺部损伤的氧自由基，最终导致肺纤维化，而后死亡[2]。

香附，中药名，莎草科植物莎草的根茎，具有疏肝解郁、理气宽中、止痛调经的作用，相关研究表明此药还具有解热、镇痛、抗炎的作用。本实验拟将香附作用于百草枯中毒的肺上皮细胞株A549，通过检测对A549细胞增殖、细胞因子TNF-α、TGF-β的表达及转录因子NF-κB表达的影响情况，初步探讨香附是否对PQ作用下的A549细胞损伤抑制作用，为寻找治疗百草枯中毒的中草药提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药品

A549细胞株(河北医科大学免疫教研室保存)香附，中药店购买，本室制成水煎液备用[3]；百草枯(PQ)，山东三元工贸有限公司生产；兔抗人NADPH、p65抗体购自CST公司；CCK-8检测试剂盒日本同仁化学产品；TNF-α、TGF-β ELISA试剂盒为Raybiotech公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 CCK-8法检测 A549细胞的增殖

A549细胞用10%FBS 1640RPMI培养基于37℃，5% CO2的培养箱中传代。收获细胞后，以5×103/孔的浓度接种96孔板，每孔100μl细胞悬液，加入不同浓度的PQ和香附提取液，将培养板在培养箱中培养24h后，吸弃上清，每孔加入含10μl CCK-8试剂的培养基100μL，将培养板在培养箱内再次孵育1.5h。

1.2.2 western-blot法检测A549细胞NF-κB P65的表达

将A549细胞以3.75×105/2mL/孔的浓度接种于6孔板，培养24h，加入不同浓度的PQ和香附提取液，于30min、1h、2h收集细胞，western-blot法检测NF-κB P65的表达。

1.2.3 ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、TGF-β、FN的表达

将A549细胞以5×104/1mL/孔的浓度接种于12孔板，加入含有不同浓度PQ和香附提取液的培养液，培养24h后，吸取上清。用ELISA方法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、纤连蛋白(FN)的表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 香附水提液对百草枯作用的A549细胞增殖的影响

为评估PQ的细胞毒性，我们用不同浓度的PQ(0～1.0mM)作用于A549细胞24h,用CCK-8试剂检测A549细胞的增殖情况，见图1A，从PQ0.2mM开始，细胞出现明显死亡现象。因此，我们选择0.3mM的PQ浓度作为PQ诱导细胞死亡的试验浓度，评价香附对PQ对A549细胞死亡的影响。另外，评价不同浓度的香附(0～8mg/mL)对A549细胞有无毒性。结果见图1B，不同浓度的香附对A549细胞的增殖无明显影响。但对PQ对A549细胞的毒性有一定的调节作用，见图1C，与对照组相比不同浓度的香附水提取液对百草枯所致的细胞损伤均有一定的保护作用，但各浓度间无显著差异。

2.2 香附水提液对PQ中毒的A549细胞NF-κB-P65表达的影响

经过试验，我们评价了香附及PQ对A549细胞转录因子NF-ΚB-P65表达的影响。结果显示，0.3mM的PQ作用于A549细胞后，NF-ΚB-P65表达在不同时间段变化不明显，但在2h时稍有降低。1mg/mL的香附作用于加入PQ的A549细胞后NF-ΚB-P65表达也无明显改变，见图2。

Western Blot结果显示，PQ作用于A549细胞0.5h、1h、2h后P65蛋白的表达与对照组相比明显增高，但各时间段之间比较无明显差异，2h的表达稍有减少。而加入香附后，在1h的时候，P65的表达量比单独PQ作用表达量减少，2h表达量不明显。

(a)不同PQ浓度对A549细胞增殖的影响 (b)不同香附浓度对A549细胞增殖的影响 (c)香附对A549细胞PQ中毒的调节作用

PQ：百草枯；X：香附，数字代表香附的含量(mg/mL)

图1 PQ和香附对A549细胞的增殖的影响

图2 香附对NF-κB信号通路的调节作用 PQ：百草枯；CR：香附

2.3 香附水提液对PQ中毒的A549细胞TNF-α、TGF-β表达的影响

用ELISA方法检测A549细胞经PQ和香附作用24h上清中TNF-α和TGF-β的表达水平。结果显示香附能促进PQ0.3mM作用的A549细胞 TNF-α的表达，见图3，TGF-β未检测出来。

图3 香附对PQ中毒的A549细胞产生TNF-α的影响

3 讨论

百草枯是农药中常见的除草剂,但对人是高毒性的药物,尤其是对肺的损伤更为严重,低剂量即可导致死亡。

A549是人的肺上皮细胞株，广泛用于肺损伤和肺纤维化研究的细胞模型[4-5]。本研究首先用不同浓度的百草枯和香附分别作用于A549细胞，PQ在0.3mM开始至1mM浓度以浓度依赖方式引起细胞死亡，而香附在所使用浓度范围内(1～8mg/mL)对A549细胞内均无致死毒性。其次，再以0.3mM的PQ浓度作为A549细胞的中毒浓度，再与不同浓度的香附共同作用于A549细胞，发现不同浓度的香附均能缓解PQ对A549细胞的致死作用。因此，可以认为香附提取液能有效缓解低剂量的PQ对A549细胞的致死作用，并可通过调节肺上皮细胞来延缓肺纤维化，这给我们的动物实验结果提供了证据[5]。

NF-κB这一转录因子参与炎症反应、免疫反应等多种生物进程[6-7]。研究发现，其在百草枯导致肺纤维化的过程中也起着重要的调控作用[8]。NF-κB是氧化应激敏感型转录因子，它在静息状态下不具有生物活性，百草枯中毒后产生大量的自由基、大量炎症细胞及细胞因子。这些物质可直接激活或间接活化 NF-κB。被激活的NF-κB进入细胞核增强促纤维化细胞因子基因的表达，使α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维数量增多，进而发挥促肺纤维化的作用。因此，实验用香附作用于PQ中毒的A549细胞，检测NF-κB-p65的表达。但结果显示NF-κB-p65在2h内未发现明显的表达变化。推测原因，一是作用时间较短。二是香附没有对该转录因子的调节作用，有待于进一步研究加以证实。

研究证明PQ引起染毒人和动物肺纤维化的重要机制之一是炎症反应学说。其中TNF-α、TGF-β在PQ感染时，经NF-κB激活后产生，促进成纤维细胞活化、增殖和成熟分化，刺激其合成大量胶原蛋白，导致肺纤维化形成。因此，本实验中检测了香附对PQ中毒的A549细胞2种细胞因子作用的影响，发现香附能促进A549细胞TNF-α的分泌，而对TGF-β的产生无影响。本结果与文献中动物试验结果不同[5]，其原因可能是在人体或动物体内TNF-α的产生来源不完全是肺上皮细胞，还有巨噬细胞等其他细胞，或者香附在体内的调节作用也不只是一种细胞，这有待于进一步研究。

总之，本研究证明了PQ可直接造成非上皮细胞的损伤，香附具有缓解PQ对细胞的毒性作用，但其机制还需要进行更深入的研究加以证实。