基于ATR-FTIR结合UPLC-DAD技术鉴别百合及其类似品

袁志鹰　李东洋　李亚林　管贺　刘湘丹　谢梦洲　黄惠勇

摘要：目的  基于傅里叶变换衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）结合超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UPLC-DAD）技术快速区分不同品种百合药材粉末。方法  采用ATR-FTIR采集百合样品红外光谱数据并导入Simca软件，建立正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，在此基础上，联用UPLC-DAD技术测定正品百合、伪品金百合及微波干燥卷丹中王百合苷A含量，分析其差异性。结果  OPLS-DA二维得分图及层次聚类分析图对卷丹与百合、卷丹与伪品金百合、热风干燥卷丹与微波干燥卷丹進行了良好的分类。卷丹的王百合苷A含量为2.09～3.28 mg/g，百合的王百合苷A含量为1.36～1.77 mg/g，伪品金百合的王百合苷A含量为1.03～1.05 mg/g，微波干燥卷丹的王百合苷A含量为3.92～4.01 mg/g。卷丹和百合中的王百合苷A含量高于伪品金百合，微波干燥卷丹的王百合苷A含量高于普通热风干燥卷丹。结论  本研究建立的方法操作简单、方便、快速，可为百合饮片、百合药膳产品开发及相关药材的质量控制提供借鉴。

关键词：百合;傅里叶变换衰减全反射红外光谱;超高效液相色谱-二极管阵列检测器;王百合苷A

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）01-0057-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201901219

Identification of Lilii Bulbus and Its Counterfeit by ATR-FTIR and UPLC-DAD

YUAN Zhiying^1，2，3， LI Dongyang¹， LI Yalin¹， GUAN He¹， LIU Xiangdan¹， XIE Mengzhou^1，3， HUANG Huiyong^1，3

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. Hunan Engineering Technology Center of Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces， Changsha 410208， China; 3. Hunan Engineering Technology Center of Functional Food Homology of Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To quickly distinguish different kinds of Lilii Bulbus powder based on ATR-FTIR and UPLC-DAD. Methods The infrared spectral data of samples were collected by ATR-FTIR， and the data was imported into Simca software to establish the orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） model. On this basis， UPLC-DAD was used to determine the content of regaloside A in genuine Lilii Bulbus and Lilium trompeten （counterfeit） and microwave dried Lilium lancifolium Thunb.， and the differences among different samples were analyzed. Results Two-dimensional score map of OPLS-DA and hierarchical cluster analysis were used to classify the three groups of Lilium lancifolium Thunb. and Lilium broumii F.E. Brown var.viridulum Baker， Lilium lancifolium Thunb. and Lilium trompeten （counterfeit）， hot-air dried Lilium lancifolium Thunb. and microwave dried Lilium lancifolium Thunb. The content of regaloside A in Lilium lancifolium Thunb. was 2.09–3.28 mg/g， 1.36–1.77 mg/g in Lilium broumii F.E. Brown var.viridulum Baker， 1.03–1.05 mg/g in Lilium trompeten （counterfeit）， and 3.92–4.01 mg/g in microwave Lilium lancifolium Thunb. The content of regaloside A in Lilium lancifolium Thunb. and Lilium broumii

F.E. Brown var.viridulum Baker was significantly higher than that in the counterfeit， while the content of regaloside A in microwave dried Lilium lancifolium Thunb. was higher than that in the hot-air dried Lilium lancifolium Thunb. Conclusion The method is simple， convenient and rapid， which can provide references for the development of medicinal diet products of Lilii Bulbus and the quality control of related medicinal materials.

Keywords： Lilii Bulbus; ATR-FTIR; UPLC-DAD; regaloside A

超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UPLC-DAD）多应用于代谢组学分析及其他一些生化领域，近年来在天然产物的分析方面运用也逐渐兴起^[1-2]。傅里叶变换衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）以其快速、绿色、样品无损等特点近年来被广泛用于中药研究^[3-5]。采用UPLC-DAD联用红外光谱技术研究中草药不同居群间药材品质差异性，对中药复杂成分体系的研究更加有利^[6]。

百合始载于《神农本草经》，2015年版《中华人民共和国药典》收录百合为卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker、细叶百合Lilium pumilum DC.的干燥肉质鳞叶^[7-10]，具有润肺止咳、养心安神功效，用于阴虚燥咳、唠嗽咳血、虚烦惊悸、多梦失眠、精神恍惚。本课题组前期在百合药材资源调研中发现，药材市场中百合以卷丹和百合2个品种为主，细叶百合很少，而同属植物金百合Lilium trompeten因亲缘关系较近被作为百合Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker代用品在市场上出售。除此之外，药材加工方式对药材活性成分亦具有明显影响^[11]。目前，百合药材鉴别主要采用外观观察、显微特征观察等传统方法。由于卷丹、百合、金百合的亲属关系近，且粉碎后原有外观性状特征消失，故传统鉴别方法难以区分不同品种及不同加工方式的百合藥材粉末。

本研究在课题组前期对百合产地环境、化学成分研究^[12-14]的基础上，采用ATR-FTIR结合Simca软件建立百合粉末定性鉴别正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，在此基础上，联用UPLC-DAD技术对正品百合、伪品金百合及微波干燥卷丹进行主要成分王百合苷A含量测定，探索其差异性特征，为快速区分百合及其同属药材、混伪品及微波干燥药材提供参考。

1  仪器与试药

Nicolet is 5傅里叶变换红外光谱仪，iD5 ATR附件（赛默飞科技公司）;Simca13.0数据分析处理软件（瑞典Umetrics公司）;202型电热恒温干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）;Agilent 1290 Infinity型超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;KM-250DE型中文液晶台式超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）;AR124CN电子天平（上海奥豪斯有限公司）;Millipore纯水仪（美国Millipore公司）。

王百合苷A对照品（批号0252-DT01，纯度98%，上海Standard Technology）;乙腈为色谱纯（韩国LG公司），乙酸为色谱纯（天津市化学试剂研究所），乙醇为分析纯（安徽安特生物化学有限公司），水为超纯水。

收集卷丹、百合及金百合样品共55批次，经湖南中医药大学药学院周日宝教授、周小江教授共同鉴定，分别为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker和金百合Lilium trompeten的干燥肉质鳞茎。卷丹：长椭圆形，顶端较尖，基部较宽，边缘薄，微波状，常向内卷曲;鳞叶长2～3.5 cm，宽1～3 cm，长宽比2～2.3，厚1～3 mm，边缘薄;乳白色或淡黄棕色，光滑、半透明，有脉纹3～8条，角质样;无臭，味微苦。百合：卵圆形或狭卵圆形，顶端稍尖;鳞叶长1.5～5 cm，宽0.5～1.5 cm，长宽比为3，厚约4 mm;表面乳白色至乳黄色，有脉纹3～5条，有的不甚明显，角质样;无臭，味微苦至无苦味。金百合：呈长椭圆形，边缘呈波状，脉纹明显。微波干燥卷丹：乳白色或淡黄棕色，表面略膨胀，其他外观形状特征和卷丹相同。取湖南龙山卷丹，水浴蒸煮5 min，样品S19～S34于60 ℃热风干燥12 h，即得热风干燥卷丹;样品S50～S55微波干燥（功率700 W）30 min，即得微波干燥卷丹。样品来源信息见表1。

2  方法与结果

2.1  定性鉴别模型的建立

2.1.1  图谱信息采集

将各批样品干燥、粉碎，过200目筛，取约0.05 g，置于ATR附件上，均匀平铺，用杠杆压紧以确保药材粉末与ATR附件紧密接触，采集红外光谱。采集条件：分辨率4 cm^-1，扫描16次，光谱扫描范围5500～600 cm^-1，背景环境中CO₂和H₂O的影响通过背景自动扣除。55批样品ATR-FTIR叠加图见图1。

2.1.2  平均光谱图分析

从图1可以看出，不同批次样品峰型相似，峰位基本相同，无法直接通过光谱图进行区分。截取S19红外光谱（见图2）进行分析可知，主要吸收特征峰波数1022 cm^-1附近吸收峰归属为羟基C-O的伸缩振动，1151 cm^-1附近吸收峰归属为酯的C-O-C的不对称伸缩振动，1506 cm^-1附近吸收峰推测归属为苯环上的C=C骨架振动，1652 cm^-1附近吸收峰推测归属为烯烃的C=C伸缩振动，2930 cm^-1附近吸收峰推测归属为烷烃C-H的伸缩振动，3648 cm^-1附近吸收峰推测归属为羟基O-H的伸缩振动。不同批次样品的光谱吸收峰有较小的差异，这可能与其产地环境因素和植株本身遗传因素不同导致其化学成分和含量不同有关。王百合苷A为百合药材的主要化学成分，其分子结构式的部分特征官能团与百合药材粉末红外光谱推测的官能团具有密切的关联性。

2.1.3  正交偏最小二乘判别分析

利用Simca软件的OPLS-DA可快速自动建模分组对比数据之间的差异性。本研究中的原始光谱经预处理后导入Simca13.0软件，分为卷丹与百合、卷丹与金百合（伪品）、热风干燥卷丹和微波干燥卷丹三个组，分别进行OPLS-DA，经自动平滑、自动基线校正预处理，OPLS-DA二维得分图可准确区分卷丹与百合、卷丹与金百合、热风干燥卷丹和微波干燥卷丹，见图3～图5。

2.1.4  层次聚类分析

采用层次聚类分析（HCA），鉴别卷丹与百合、热风干燥卷丹与微波干燥卷丹、卷丹与金百合，在聚类树状图中将每一类进行标记，分组显示误判个数为0，识别准确率为100%，见图6。

2.2  王百合苷A含量差异性分析

2.2.1  色谱条件

色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;流动相：乙腈-0.5%乙酸;梯度洗脱：0～13 min，2%～2%A;13～15.2 min，2%～5%A;15.2～17.5 min，5%～5%A;17.5～19.5 min，5%～12%A;19.5～22.0 min，12%～25%A;22.0～25.0 min，25%～50%A;25.0～27.0 min，50%～90%A;27.0～29.0 min，90%～95%A;29.0～31.05 min，95%～2%A;31.05～32.0 min，2%～2%A;流速：0.2 mL/min;柱溫：30 ℃;进样体积：2.00 μL;DAD选择最大吸收波长：309 nm。色谱图见图7。

2.2.2  供试品溶液制备

取样品干燥，粉碎，过200目筛，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，避光静置1 h，称定质量，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用80%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤（0.22 μm），取续滤液，即得。

2.2.3  对照品溶液制备

分别精密称取王百合苷A对照品适量，置于量瓶中，加80%乙醇溶解稀释，配制成浓度分别为0.556、0.680 mg/mL的对照品溶液。

2.2.4  方法学考察

2.2.4.1  精密度试验

选取对照品溶液，按“2.2.1”项下条件进行UPLC分析，连续测定6次，记录色谱图，王百合苷A峰保留时间RSD=0.02%，峰面积RSD=0.25%，表明本方法精密度好。

2.2.4.2  重复性试验

精密称取样品S14，平行制备6份供试品溶液，进行UPLC分析，结果供试品溶液中王百合苷A峰保留时间RSD=0.04%，峰面积RSD=0.48%，表明本方法重复性良好。

2.2.4.3  稳定性试验

取样品S14，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”项下色谱条件进行UPLC分析，结果24 h内供试品溶液中王百合苷A保留时间RSD=0.04%，峰面积RSD=0.84%，表明本方法稳定性良好。

2.2.4.4  线性关系考察

精密量取王百合苷A对照品，置于量瓶中，加入80%乙醇溶解并稀释，摇匀，配成浓度为0.5、10、50、100、333、500 μg/mL的系列标准溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进行UPLC分析，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得线性回归方程Y=20.988X+35.254（r=0.999 2），线性范围为1.0～1000 ng。

2.2.4.5  加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（S14）粉末9份，每份0.5 g，每3份样品分别精密加入1、2、4 mL王百合苷A对照品溶液。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进行UPLC分析，计算加样回收率。结果王百合苷A平均加样回收率为102.43%，RSD=1.25%，表明回收率良好，见表2。色谱图见图8。

2.2.5  样品王百合苷A含量测定

取卷丹（12批次）、热风干燥卷丹（10批次）、百合（4批次）、金百合（3批次）和微波干燥卷丹（3批次）样品，每批3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，并计算样品中王百合苷A含量。结果表明，不同样品中王百合苷A含量存在差异。卷丹的王百合苷A含量为2.09～3.28 mg/g，百合的王百合苷A含量为1.36～1.77 mg/g，金百合的王百合苷A含量为1.03～1.05 mg/g，微波干燥卷丹的王百合苷A含量为3.92～4.01 mg/g。卷丹和百合的王百合苷A含量明显高于伪品金百合，而微波干燥卷丹相对普通的热风干燥卷丹的王百合苷A含量更高。

3  讨论

ATR-FTIR作为一种绿色、无损的样品分析手段，结合OPLS-DA可以更好区分组间差异，提高模型的有效性和解析能力。通过ATR-FTIR结合OPLS-DA分析，可将卷丹与百合、微波干燥卷丹与热风干燥卷丹、卷丹与伪品金百合药材粉末在OPLS-DA得分图上区分开（同品种样本聚合，不同品种样本离散）。在此基础上，采用UPLC-DAD对百合主要化学成分王百合苷A进行含量测定，发现不同批次样品中王百合苷A含量存在明显差异，微波干燥卷丹>卷丹>百合>金百合。王百合苷A为百合的主要化学成分，其分子结构部分特征官能团与百合药材粉末红外光谱推测的官能团可能具有一定的关联性。

百合作为湖南省大宗药食两用主产药材，近年来市场需求旺盛。由于正品百合价格较高，百合和卷丹中掺杂金百合现象较为常见，而金百合相关研究报道较少。且药材打粉后失去原有性状，难以鉴别，因此采用ATR-FTIR结合UPLC-DAD技术快速鉴别百合药材粉末具有重要意义。

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（收稿日期：2019-01-18）

（修回日期：2019-03-05;编辑：陈静）

基金项目：国家中药标准化项目（ZYBZH-Y-HUN-24）;国家中医药管理局项目（201728）;湖南省自然科学基金（2019JJ50446）;长沙市科技计划（kq1801044）;湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心开放基金（2018-02-01）;湖南中医药大学中药学一流学科（2018年）

通讯作者：黄惠勇，E-mail：huanghy68@126.com