针药结合对脑卒中肢体痉挛大鼠脑组织海马γ-氨基丁酸a型受体和脑源性神经营养因子表达的影响

黄麟荇　王彭汉　郭斌　谢志强　谢莉娜　刘未艾　易丽贞　刘欣　岳增辉

摘要：目的  觀察针药结合对脑卒中肢体痉挛大鼠脑组织海马γ-氨基丁酸a型受体（GABAa）和脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响，探究针药结合治疗脑卒中后肢体痉挛的作用机制。方法  采用中动脉线栓结合内囊注射NMDA受体制作脑卒中肢体痉挛大鼠模型。45只实验大鼠随机分为模型组、针药结合组（针刺阳陵泉、曲池+加味芍药甘草汤水煎剂灌胃）、西药组（巴氯芬溶液灌胃）、空白组（不做任何处理）和假手术组（干预同模型组，只分离不结扎不插线）。各治疗组大鼠成模后第1日开始干预，连续5 d。采用RT-PCR和Western blot分别检测大鼠脑组织海马BDNF、GABAa mRNA和蛋白的表达。结果  与空白组比较，假手术组大鼠神经功能、肌张力评分差异无统计学意义（P>0.05），模型组大鼠神经功能和肌张力评分明显增加（P<0.01）;与模型组比较，西药组和针药结合组大鼠神经功能、肌张力评分明显降低（P<0.05），BDNF、GABAa mRNA和蛋白表达均显著升高（P<0.01）;与西药组比较，针药结合组变化不明显（P>0.05）。结论  针药结合可改善模型大鼠神经功能，保护神经损伤，缓解卒中后肢体痉挛，其机制可能与上调模型大鼠脑组织海马中GABAa、BDNF mRNA和蛋白的表达相关。

关键词：针药结合;脑卒中肢体痉挛;脑源性神经营养因子;γ-氨基丁酸a型受体;大鼠

中图分类号：R245;285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）01-0045-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905020

Effects of Acupuncture Combined with Medicine on Expressions of γ-aminobutyric Acid Type a Receptor and Brain-derived Neurotrophic Factor in Hippocampus of Rats withLimb Spasm Caused by Cerebral Stroke

HUANG Linxing¹， WANG Penghan¹， GUO Bin¹， XIE Zhiqiang¹， XIE Lina¹， LIU Weiai²，YI Lizhen¹， LIU Xin¹， YUE Zenghui¹

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China;2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410005， China

Abstract： Objective To analyze the effects of acupuncture combined with medicine on the expressions of γ-aminobutyric acid type a receptor （GABAa） and brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampus of rats with limb spasm caused by cerebral stroke; To explore the mechanism of acupuncture combined with medicine for limb spasm caused by cerebral stroke. Methods A rat model with limb spasm caused by cerebral stroke was made by injecting NMDA receptor into the middle capsule with a middle artery suture. Totally 45 SD rats were randomly divided into model group， acupuncture-medicine combination group （acupuncture on Yanglingquan and Quchi + modified Shaoyao Gancao Decoction for gavage）， Western medicine group （baclofen solution for gavage）， blank group （without any intervention） and sham-operation group （the same intervention as the model group， only being separated without ligation without plugging）. Each administration group was intervened on the first day after the successful establishment of the model， and continued for 5 days. The expressions of BDNF， GABAa mRNA and protein in hippocampus of rats were detected by Western blot and RT-PCR， respectively. Results Compared with the

blank group， there was no statistical significance in nerve function and muscle tension in the sham-operation group （P>0.05）， but the scores of nerve function and muscle tension in the model group increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the scores of nerve function and muscle tension in the Western medicine group and acupuncture-medicine combination group decreased significantly （P<0.05）， but the expressions of BDNF， GABAa mRNA and protein increased significantly （P<0.01）. Compared with the Western medicine group， the changes of the acupuncture-medicine combination group were not obvious （P>0.05）. Conclusion Acupuncture combined with medicine can improve neurological function in rats， protect nerve injury and relieve limb spasm caused by cerebral stroke. The mechanism may be related to the up-regulation of expressions of GABAa and BDNF mRNA and protein in hippocampus of model rats.

Keywords： acupuncture-medicine combination; limb spasm caused by cerebral stroke; brain-derived neurotrophic factor; γ-aminobutyric acid type a receptor; rats

腦卒中因其有发病率、死亡率、致残率、复发率高的特点，已成为严重危害人类健康的疾病^[1]。随着医疗水平的提高，其病死率明显下降，但致残率仍居高不下^[2]。相关资料显示，约4/5脑卒中偏瘫患者会出现不同程度肢体痉挛^[3]，严重影响肢体运动功能的恢复。针药结合疗法是临床治疗脑卒中后肢体痉挛状态的有效手段。研究表明，针药结合能有效降低肌张力、改善肢体运动功能、提高日常活动能力^[4-6]。课题组前期临床研究显示，经筋刺法结合加味芍药甘草汤能更好地缓解脑卒中后偏瘫患者的肌肢体痉挛^[7]。现代医学认为，抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）影响卒中后痉挛的形成和加强，是中枢神经系统中最重要的抑制性物质^[8]，其与γ-氨基丁酸a型受体（GABAa）在突触后膜相结合，抑制过度神经元放电，从而防止痉挛的发生^[9]。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作为神经系统发育过程中的关键信号分子，在中枢神经系统广泛分布，是在脑内合成的一种小分子碱性蛋白，对神经系统发育非常重要。其参与GABA能神经元可塑性的调节，对GABA能神经元的可塑性起着关键作用^[10]。因此，本实验观察电针结合加味芍药汤对脑卒中后肢体痉挛大鼠海马区GABAa和BDNF表达的影响，探究其缓解肢体痉挛状态的可能作用机制，为临床治疗提供依据。

1  材料与方法

1.1  动物及分组

SPF级雄性SD大鼠45只，体质量（240±30）g，湖南中医药实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（湘）2016-0002，动物质量合格证号43004700044333。饲养于湖南中医药大学动物实验室中心清洁级动物实验房，室温20～25 ℃，相对湿度50%～70%，通风良好，普通饲料喂养。动物适应性喂养1周后编号，将45只大鼠按随机数字表分为空白组、假手术组、模型组、西药组和针药结合组，每组9只。

1.2  药物

加味芍药甘草汤（白芍30 g，甘草10 g，炙黄芪 30 g，当归15 g，川芎15 g，地龙10 g，鸡血藤15 g，木瓜10 g，桑枝30 g，伸筋草10 g，山萸肉10 g，枸杞子10 g），饮片购自湖南中医药大学第二附属医院中药房，按比例配方取药，蒸馏水浸泡1 h，继以武火急煎至沸腾，再以文火煎煮2 h，取汁后以纱布过滤，药渣再加蒸馏水文火煎煮1 h，过滤取汁。合并2次药汁，浓缩至含原药材10 g/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。巴氯芬片，福安药业集团宁波天衡制药有限公司，批号180503C01，10 mg/片，研成细粉末，溶于蒸馏水，配制成0.27 mg/mL溶液备用。

1.3  主要试剂与仪器

NMDA受体（武汉华联科生物技术有限公司），Rabbit bs-1232R GABA A Receptor alpha 1（Bioss），Rabbit ab108319 BDNF（Abcam）。大鼠脑立体定位仪（日本成茂公司，SN-2），牙科钻（南京金恒川电子有限公司，MF4G），离心机（德国Eppendorf，Centrifuge5424R），LRH-150 37 ℃恒温培养箱（上海一恒），电泳仪（BIO-RAD，miniprotean3cell），酶标仪（芬兰雷勃，MK3），微量移液枪（美国RaininPiPet-Lite），JY045-3C凝胶成像系统（北京君意），电针仪（苏州医疗用品厂有限公司，SDZ-V），华佗牌0.3 mm×13 mm一次性针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）。

1.4  造模

采用改良中动脉线栓法结合内囊注射NMDA受体制作脑卒中肢体痉挛大鼠模型^[11]。腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，备皮、消毒、铺巾、钝性分离，结扎颈外动脉（ECA）近心端、颈总动脉（CCA）远心端，动脉夹夹闭颈内动脉（ICA），插线，完毕后将ICA近心端和栓线一起结扎，缝合切口。将Zea Longa评分^[12]1～3分大鼠第2日再行内囊注射NMDA受体^[13]。将麻醉成功大鼠固定于脑立体定位仪上，行常规备皮、消毒、铺巾，沿颅顶矢状缝作纵行切口，暴露右侧顶骨和额骨交界骨缝，按《大鼠脑立体定位图谱》^[14]确定内囊位置，用牙科钻钻取小孔，缓慢注射5 μL NMDA，持续5 min，注射完毕拔出微量注射器，压迫止血并消毒，缝合。术后均予以青霉素抗感染;腹腔注射速尿，防止脑水肿。大鼠苏醒后，Zea Longa评分^[12]1～3分，Ashworth肌张力评分^[15]≥1分，表明脑卒中后肢体痉挛模型成功。

1.5  干预

模型组大鼠单笼饲养，饲料喂养，投喂葡萄糖水，青霉素肌注，共4 d;假手术组同模型组，只分离不结扎也不插线;西药组将制备好的巴氯芬水溶液按成人量换算成动物剂量，给药体积为1 mL/100 g体质量，1次/d，连续5 d;假手术组和模型组均灌服等量生理盐水，1次/d，连续5 d;针药结合组大鼠针刺阳陵泉、曲池，并予加味芍药甘草汤水煎剂灌胃。电针取双侧曲池、阳陵泉，穴位定位参照《实验针灸学实验指导》^[16]，并结合解剖学方法进行大鼠穴位定位。阳陵泉：距足三里（膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处）上外侧5 mm，直刺6 mm。曲池：桡骨近端关节外侧前方的凹陷中，直刺4 mm。将大鼠固定于鼠板上，消毒，采用华佗牌0.3 mm×13 mm一次性针灸针，捻转角度90～180°，频率60～90次/min，持续1 min，针后选用SDZ-V电针治疗仪，密波，频率100 Hz，以大鼠肢体轻微抖动为度。将制备好的加味芍药甘草湯水煎液温热，剂量按照成人量换算成动物剂量，灌胃体积为1 mL/100 g体质量，先行加味芍药甘草汤灌服;再行电针治疗，每次30 min，均每日1次，连续5 d。

1.6  行为学检测

1.6.1  大鼠神经功能评分

参照Zea Longa评分标准^[12]进行神经功能评分：0分为无神经损伤症状;1分为不能完全伸展手术对侧前爪或后爪;2分为行走时向手术对侧转圈;3分为行走时向手术对侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。分别在造模后及治疗结束后各评分1次。

1.6.2  大鼠肌张力评分

根据改良人类Ashworth肌张力评分法^[15]，对大鼠综合肌张力进行评分。0级：无肌张力增加，大鼠活动自如;1级：轻微增加，抓握中被动屈伸至最后有小的阻力;1⁺级：轻度增加，抓握至一半关节活动度（ROM）以上有轻度阻力增加;2级：肌张力在大部分ROM中均有较大增加，但肢体被动运动容易;3级：肌张力明显增加，被动活动困难;4级：受累部分肢体强直性屈曲或伸直。将0、1、1⁺、2、3、4级分别记为0～5分，分数越高说明肌张力越差。分别在造模后及治疗结束各评分1次。

1.7  取材

大鼠行为学检测结束后，采集标本。断头处死大鼠，冰台上快速取大脑海马组织放入冻存管，放入液氮降温1 d，置于-80 ℃环境冻存备用。

1.8  RT-PCR检测大鼠脑组织海马区γ-氨基丁酸a型受体和脑源性神经营养因子mRNA表达

采用Trizol一步法提取总RNA，获得RNA溶液，置于-80 ℃冰箱保存备用。RNA中DNA消除：37 ℃，30 min;Hold，加1 μL EDTA;65 ℃，10 min。总RNA中DNase1消除：将反应液加入与其等量的苯酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，适量DEPC-H₂O溶解，进行反转录。反应条件：42 ℃，60 min;70 ℃，15 min;16 ℃，循环;反转录产物置于-20 ℃保存备用。将制备好cDNA进行PCR扩增，反应程序：95 ℃、3 min，95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，39个循环;65 ℃、5 s，95 ℃、50 s。计算ΔCt值，以2^-ΔΔCt分析各基因相对表达量。以β-actin作为内参基因，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，详见表1。

1.9  Western blot检测大鼠脑组织海马区γ-氨基丁酸a型受体和脑源性神经营养因子蛋白表达

将组织剪成细小的碎片，每20 mg组织加150～250 μL裂解液，匀浆直至完全裂解。裂解后4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清液，进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱，根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度（6%、12%），再根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min 使蛋白变性，离心，取上清液上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，转膜。室温封闭2 h后加入一抗和膜，室温孵育1 h，膜用PBST洗涤3次×5 min。随后根据用量，按1∶10 000稀释HRP标记二抗，与膜室温孵育1 h。PBST洗3次×5 min，显色后通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

1.10  统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料用样本含量、±s或n、M（QR）表示，所有数据均进行正态性和方差齐性检验。满足正态性及方差齐性时，组内治疗前后比较采用配对t检验，组间比较采用方差分析，不满足正态性或方差齐性，则采用非参数检验;多组间比较采用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett'T3法;不满足正态性选择秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  行为学检测结果

2.1.1  大鼠神经功能评分结果

与空白组比较，假手术组大鼠神经功能评分无明显差异（P>0.05），模型组大鼠神经功能评分明显增加，差异有统计学意义（P<0.01），提示造模成功;与模型组比较，西药组和针药结合组大鼠神经功能评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

2.1.2  大鼠Ashworth评分结果

与空白组比较，假手术组大鼠Ashworth评分无明显差异（P>0.05），模型组评分明显增加，差异有统计学意义（P<0.01），提示造模成功;与模型组比较，西药组、针药结合组大鼠Ashworth评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。

2.2  针药结合对模型大鼠海马脑源性神经营养因子和γ-氨基丁酸a型受体mRNA表达的影响

与空白组、假手术组比较，模型组大鼠海马BDNF、GABAa mRNA表达明显降低，差異有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，西药组、针药结合组大鼠海马BDNF、GABAa mRNA表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较，针药结合组大鼠海马BDNF、GABAa mRNA表达变化不明显（P>0.05）。结果见表4。

2.3  针药结合对模型大鼠海马大鼠海马脑源性神经营养因子和γ-氨基丁酸a型受体蛋白表达的影响

与空白组、假手术组比较，模型组大鼠海马BDNF、GABAa蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，西药组、针药结合组大鼠海马BDNF、GABAa蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较，针药结合组大鼠海马BDNF、GABAa蛋白表达变化不明显（P>0.05）。见表5、图1。

3  讨论

中医学认为，中风后肢体痉挛多由阴虚血少或跷脉病变所致，如《景岳全书》：“其病在血液，血液枯燥，所以痉挛”“凡属阴虚血少之辈，不能营养筋脉，以致搐挛僵仆者，皆是此证，如中风之有此者，总属阴虚证。”《难经·二十九难》“阴跷为病，阳缓而阴急;阳跷为病，阴缓而阳急”，其病位在筋;临床表现筋肉拘急、屈伸不利，应归属于十二经筋的病候，而非十二正经的病候;治法为祛邪扶正、舒筋缓急^[17]。阳陵泉是足少阳胆经合穴，为八会穴之筋会，《针灸聚英》：“主膝伸不得屈，骸枢膝骨冷痹，脚气，膝股内外廉不仁，偏风半身不遂，脚冷无血色，苦嗌中介然，头面肿，足筋挛。”阳陵泉是治手足拘挛、抽搐转筋常用穴位，是治疗全身筋病要穴。曲池为多气多血的手阳明经合穴，位于肘部，《针灸大成·卷六》言其：“主绕踝风，手臂红肿，肘中痛，偏风半身不遂”，故曲池具有通经络、调气血、祛利关节、止痹痛之功。《伤寒论》云：“夜半阳气还，两足当温，胫尚微拘急，重与芍药甘草汤，尔乃胫伸。”芍药甘草汤为治疗“足痉急，不得伸”的名方，功专滋阴补肝、养血柔筋、缓急止痉，用于伤寒后误汗亡阳、阳复而筋脉挛急之证。因此，针刺阳陵泉、曲池结合加味芍药甘草汤能更好缓解脑卒中后肢体痉挛状态以促进脑卒中患者的康复，提高患者生存质量。

现代医学认为，脑卒中后中枢神经系统抑制性神经递质GABA减少或兴奋性神经递质谷氨酸（Glu）增加都会导致痉挛^[18]。GABA作为抑制性神经递质的代表，由脑组织内的兴奋性神经递质Glu在谷氨酸脱羧酶的作用下脱去羧基形成^[19];Glu和GABA介导的兴奋性突触传递和抑制性突触传递是维持神经系统兴奋/抑制平衡的重要基础^[20]。其中GABAa受体是主要介导GABA导致的快速抑制性突触传递的受体^[21];GABA与GABAa受体结合后，可引起突触后膜GABAa通道开放，Cl^-电导增加，又因为大多数情况下胞内Cl^-低于胞外，所以Cl^-内流，导致突触后膜超极化，产生快速抑制性突触后电位，抑制神经元放电，产生突触后抑制效应^[22]。BDNF作为神经系统发育过程中的关键信号分子，在中枢神经系统中对促进神经元的存活至关重要^[23]。它与GABA相互调节：GABA可以促进BDNF的转运和表达水平^[24]，BDNF也可以促进海马GABA的转录活性^[25]。研究发现，BDNF参与GABA能神经元可塑性的调节，BDNF对GABA能神经元的可塑性起着关键作用^[26];并且BDNF参与调节Glu和GABA能突触的突触后神经递质受体的数量与分布^[27]。

研究显示，针刺可通过升高GABA含量或增加GABA受体的表达，抑制肢体痉挛状态;也可通过升高卒中后肢体痉挛状态大鼠血清BDNF含量，并促进受损神经的修复，缓解肢体痉挛状态^[17，28-30]。但关于针药结合治疗脑卒中后肢体痉挛作用机制研究鲜有报道。本研究结果显示，针药结合不仅可通过升高GABAa mRNA和蛋白的表达，产生突触前和突触后的抑制作用，而且可通过上调脑组织海马中BDNF mRNA和蛋白的表达，促进神经功能恢复，保护神经损伤，两者相互调节能更好地促进神经功能发育和再生，缓解卒中后肢体痉挛。因此，针药结合防治脑卒中后肢体痉挛状态的机制可能是通过上调脑组织海马BDNF、GABAa mRNA和蛋白表达而实现的，这为临床上治疗脑卒中后肢体痉挛提供了理论依据。

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（收稿日期：2019-05-03）

（修回日期：2019-06-20;编辑：华强）

基金项目：国家自然科学基金（81673886）;湖南省自然科学基金（2018JJ2294）;湖南省中医药科研计划项目（201828）;湖南省研究生科研创新项目（CX2018B488）

通讯作者：岳增辉，E-mail：624755064@qq.com