长链非编码RNA GAS5及高通量分析在大隐静脉曲张诊疗中应用

李 磊，曹忠文

(吉林省前卫医院 血管外科，吉林 长春130012)

大隐静脉曲张是一种较为常见的血管外科疾病，患者多以下肢肿胀和疼痛为主诉,若不及时治疗会导致血液在曲张的静脉内瘀滞从而形成血栓，并会引起肺动脉栓塞进而导致严重后果[1]。严重的大隐静脉曲张诊疗较为容易，通过患肢站立时视诊及血管彩超均可诊断。但如何在曲张早期尚未引起严重并发症时进行诊断目前仍有困难。近年来非编码RNA在病变组织和健康组织中存在差异性表达使其成为了研究热点，并且这些非编码RNA在机体内广泛存在且在疾病发展的早期阶段即呈现差异性表达，使其有望成为各种疾病早期诊断的新的血清学标志物及治疗的靶点[2]。而长链非编码RNA GAS5已经被证实在癌症及血管病变中参与疾病的发生和发展[3,4]，但其是否能够在大隐静脉曲张的早期诊断及治疗中发挥作用目前尚不明确。故本文通过验证大隐静脉组织中GAS5差异性表达并进行高通量生物信息学分析来明确GAS5对大隐静脉曲张中的诊断及治疗价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2016年1月—2018年6月就诊于吉林省前卫医院血管外科的大隐静脉曲张患者49例。全部患者均行大隐静脉剥离手术治疗，并经病理学组织检查确诊为大隐静脉曲张。排除标准：①继发性静脉曲张。②既往有深静脉血栓形成、浅表血栓性静脉炎、血栓后综合征、Klippel-Trenaunay综合征、May-Thurner综合征或任何其他静脉疾病病史。其中男20例，女29例，平均年龄54.1±9.2岁。对照组为正常的大隐静脉患者50例，其中男26例，女24例，平均年龄57.6±9.1岁。组织取自冠状动脉旁路移植手术后剩余的大隐静脉。入组病例一般基本资料详见表1。本实验经吉林省前卫医院伦理委员会审核并批准，全部患者同意将手术切取的大隐静脉作为科研使用，并在手术前签署本项目知情同意书。

表1 3组患者一般资料比较

*P<0.05；表中数据以均数±标准差或例(%)表示

1.2 高通量分析长链非编码RNA芯片表达结果GSE51260来源于GEO数据库(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。选取其中5例病变组织和5例正常组织。通过GEO2R软件进行差异表达基因分析。差异表达筛选标准为(差异倍数在2倍以上及P<0.05)。Graphpad prism 7进行差异基因的火山图绘制。利于miRDB (www.mirdb.org) and TargetScan (www.targetscan.org)[5]高通量数据筛选工具进行靶基因及相关的结合基因进行预测。Cytoscape软件进行共表达网络图绘制。

1.3全部患者标本均为术中手术切取获得。RNA提取采用TIANDZ(天恩泽)试剂盒。NanoDrop2000 超微量分光光度进行RNA浓度及纯度的检测，纯度OD260/OD280选择在1.8-2.0之间的RNA。RNA逆转录为cDNA采用All In One cDNA逆转录试剂盒，逆转录过程严格按照All In One cDNA试剂盒说明书进行，逆转录所用RNA量为1 μl，总反应体系13 μl。反应条件为60℃10 min，4℃5 min。逆转录的cDNA放在冰中保存并进行下一步反应。

1.4 实时定量PCR操作仪器为ABI公司生产的7500 Real time PCR机器，采用ABI公司生产的配套96孔PCR板， 反应体系为20 μl，采用All In One PCR试剂盒。因为根据Primer-primer设计并由华大基因公司设计，具体序列见表2，反应条件为:95 ℃ 10 min;95 ℃15 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，40 cycles；95℃15s，60℃ 1 min，95℃15 s。每组样品均设3 个重复。

表2 荧光定量引物表

2 结果

2.1芯片结果显示总共对27126个基因进行检测，其中24938个基因无明显变化，745个上调差异性表达的基因，1443个下调差异性表达的基因。对上述数据进行火山图差异表达基因绘制，显示如图1。

2.2在49例大隐静脉曲张患者组织标本中，长链非编码RNAGAS5 均在组织中表达，诊断阳性率达100%。RT-PCR检测结果发现 GAS5在病变组(4.37±0.14)和对照组(5.62±0.31)之间呈现差异性低表达，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.3GENE数据库(GENE,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)显示GAS5的碱基序列为1 gtcttttcga ggtaggagtc gactcctgtg aggtatggtg ctgggtgcag atgcagtgtg 61 gctctggata gcaccttatg gacagttgtg tccccaagga aggatgagaa tagctactga121 agtcctaaag agcaagccta actcaagcca ttggcacaca ggcattagac agaaagctgg 181 aagttgaaat ggtggagtcc aacttgcctg gaccagctta atggttctgc tcctggtaac 241 gtttttatcc atggatgact tgcttgggta aggacatgaa gacagttcct gtcatacctt 301 ttaaaggtat ggagagtcgg cttgactaca ctgtgtggag caagttttaa agaagcaaag 361 gactcagaat tcatgattga agaaatgcag gcagacctgt tatcctaaac tagggttttt 421 aatgaccaca acaagcaagc atgcagctta ctgcttgaaa gggtcttgcc tcacccaagc 481 tagagtgcag tggcctttga agcttactac agcctcaaac ttctgggctc aagtgatcct 541 cagcctccca gtggtctttg tagactgcct gatggagtct catggcacaa gaagattaaa 601 acagtgtctc caattttaat aaatttttgc aatccatcaa aaaaaaaaaa aaaaaa。miRDB (www.mirdb.org)对GAS5可能结合的miRNA进行预测提示6种miRNA分别为hsa-miR-548aw(score 83)，hsa-miR-1261(score 62)，hsa-miR-6888-3p(score 60)，hsa-miR-4673(score 55)，hsa-miR-4645-5p(score 55)，hsa-miR-1304-5p (score 55)。TargetScan (www.targetscan.org)对上述6个miRNA进行靶基因的预测，ESR1，BMPR2，PPP1R15B，KBTBD8，RIMS2，PLXNA4；GSG1L，NRXN1，KCNK12，ZCWPW2，NAIP，INSIG1；CREB3L3，ZFAND1，ADGRF5，ABHD10，PDAP1，SOX14；FGFRL1，UBFD1，SH3PXD2B，SMAD4，KCTD6，WWTR1；NPHP3，FBXO45，CAPRIN2，TET3，OCSTAMP，ENTPD1；ANXA2，NXPH1，GCC1，SLC35B4，ACTR1A，VTA1。选取预测分数校高的基因进行共表达网络图绘制，如图3。

图1 大隐静脉曲张组织与正常组织差异表达基因火山图

图2 RT-PCR检测GAS5在病变及正常大隐静脉组织的表达量

图3 共表达网络图绘制预测GAS5的相关通路

3 讨论

大隐静脉曲张是下肢血管疾病中较为常见的一种。其好发于30-70岁之间，女性患者较为多见。目前大隐静脉曲张的具体发病机制尚不清楚，普遍认为和血管壁先天发育异常和血管内压力过高相关。而对于有静脉曲张家族史患者和长久站立的人更容易诱发大隐静脉曲张。患者以站立时静脉曲张为主要临床表现并伴有下肢疼痛肿胀和营养障碍为主。此疾病目前诊断较为容易，但是一般等到疾病发展到较容易诊断时已经到了终末期大隐静脉曲张。如何能在早期对此类疾病进行诊断，进而通过对危险因素的干预来起到延缓大隐静脉曲张的发生目前仍未有报道。

近年来，长链非编码RNA[6]逐渐被发现在疾病的发生发展中起到重要的调控作用。而对于具有遗传倾向的疾病中，其在疾病尚处于发展过程中即呈现差异性表达。故有报导指出其可作为一种新的血清标志物对疾病进行早期诊断。这种长度大于200个核苷酸的不具备编码功能的RNA，在体内表达较为丰富，广泛存在于体液如唾液、血液、尿液中，使得临床检验较为方便和简单。故本文通过对既往数据库大量信息的挖掘和分析并根据文献报道，欲验证长链非编码RNA GAS5对大隐静脉曲张的诊断价值，并通过高通量信息分析手段预测其可能的调控机制。

我们对数量高达27126个长链非编码基因进行检测，发现其中有745个上调差异性表达和1443个下调差异性表达的基因。这些基因的差异表达倍数均较正常组织超过2倍，最高差异表达倍数为5.54倍，提示上述差异表达的基因可能都参与大隐静脉曲张的表达。而据文献报道，GAS5参与干细胞的自我更新[7]、膀胱细胞的坏死调控[8]、前列腺癌细胞[9]的增殖和凋亡等。其中有报道称其可通过TGF-β信号通路参与调节平滑肌细胞的增殖过程[10]。而大隐静脉血管壁中也主要由平滑肌细胞组成，故本文长链非编码芯片分析结果提示GAS5可能通过对静脉血管平滑肌细胞的调节进而引起血管壁薄弱而导致静脉曲张。为进一步验证上述说法，我们首先对49例大隐静脉曲张组织进行GAS5基因的检测，发现GAS5基因在全部病变组织中呈现差异性低表达，阳性率可达100%。随后我们对GAS5基因进行高通量分析，首先我们通过miRDB软件发现其可能通过“分子海绵”作用微小RNA进而发挥调控机制，其可能吸附hsa-miR-548aw,hsa-miR-1261,hsa-miR-6888-3p,hsa-miR-4673,hsa-miR-4645-5p,hsa-miR-1304-5p这6种微小RNA进行对血管平滑肌细胞通路的调控，这与既往报道结果相似。而进一步通过TargetScan对上述6个miRNA的靶基因进行预测我们发现，Annexin A2(ANXA2)是hsa-miR-4673调控的靶基因。而ANXA2既往报道参与到血管平滑肌细胞的增殖和凋亡的调控中[4]。故GAS5可能通过对hsa-miR-4673吸附作用进而影响ANXA2导致血管平滑肌细胞凋亡最终引起血管壁的薄弱导致静脉曲张。

总之，通过对大样本的验证发现GAS5在大隐静脉曲张组织中呈现差异性低表达提示GAS5可能作为诊断大隐静脉曲张的一种潜在血清标志物。而高通量分析也高度提示GAS5通过hsa-miR-4673调控ANXA2进而影响血管平滑肌细胞的增殖，也说明检测GAS5对大隐静脉曲张患者特别是曲张早期的患者具有诊断价值。