肿瘤坏死因子-α对微循环障碍大鼠心功能的影响*

栾绍华 张 磊 杨 超 韩爱子 刘津军

心肌梗死是严重威胁人类健康的重大疾病之一，研究表明其发病原因可能与远端血管栓塞、血小板聚集引起的无复流、机械阻塞微循环，或因局部对栓塞引起的微血管痉挛等有关[1-4]。尽管目前心肌梗死疗效得到极大改善，但是仍有相当一部分患者出现进行性心功能损害[5]。心肌梗死的防治研究仍必不可少。已有研究提出炎性标志物，特别是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是造成心肌缺血坏死后收缩功能损害的重要原因[6,7]。本研究使用自体微血栓法构建冠脉微循环障碍大鼠模型[8]，观察大鼠微循环障碍后心功能的改变，并探讨其机制是否与TNF-α有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

30只SPF清洁级SD雄性大鼠购自南京大学模式动物研究所，月龄2个月，体重250-300g,随机均分为模型组和对照组(n均=15)。将模型组大鼠按照TNF-α的含量分为高炎组(≥170pg/ml)和低炎组(<170pg/ml)。

1.2 动物模型制备

根据文献[8]自体血栓栓塞法建模，取已过一周适应期SD雄性大鼠，剪尾、取血约1ml，待血液体外自凝后用无菌玻璃研磨器研磨5min，使其成为约30μm大小均匀的颗粒状悬液备用。模型组大鼠常规麻醉(1%戊巴比妥钠50mg/kg，腹腔注射)后接小动物呼吸机辅助呼吸。经左侧胸壁第2肋间逐层开胸，撕开心包，暴露主动脉根部。用动脉夹夹住升主动脉，用胰岛素注射器(0.5ml)分两次将0.2ml自体血栓颗粒注入主动脉根部，10s后松开钳夹，压迫止血后关胸复苏。术后给予青霉素(80 000U，肌注3 天)预防感染。对照组用等量生理盐水替代自凝血颗粒悬液，其余步骤相同。模型组除1只大鼠在造模2天后死亡外，其余大鼠2周后经冠状动脉微循环阻力指数(IMR)检测显示均造模成功。

1.3 观察指标和方法

1.3.1大鼠IMR检测：两组动物均于造模后2周检测IMR。参考文献[9]，静脉注射5 000-10 000U肝素，经6-7F指引导管冠脉内注入硝酸甘油200-300μg，再经指引导管推送0.014英寸的软压力导丝到冠脉口，使测定的压力与顶端带有温度感受器导丝的压力一致，并校正同一位置的温度信号。将压力导丝头端放至血管远端至少2/3处(确定好位置后，不再移动)，按照屏幕提示，用5ml注射器经指引导管内弹丸式快速注射室温生理盐水3ml；当温度感受器检测到温度的变化时，记录第一条温度曲线；当盐水距离导丝头端3cm处的温度感受器时，记录第二条温度曲线，两条温度曲线触发的时间差即为平均传导时间，记作Tmn。重复3次，取平均值。然后将15-20mg罂粟碱注入冠脉内达最大稳定充血状态，注射室温生理盐水3ml，把温暖的液体从指引导管内冲出，按照屏幕提示快速注射3ml室温生理盐水，重复测3次，从而得到最大充血状态下的平均传导时间(hTmn)，同时可测得远端冠状动脉压力(Pd)。根据公式计算IMR值(=Pd×hTmn)。

1.3.2左室短轴缩短率(FS)检测：在行IMR检测后隔天，使用加拿大 VisualSonics公司Vevo770 Miro Ultrasound影像系统对大鼠心脏结构和功能进行超声检测，探头频率17.5MHz，探测深度2cm，扫描速度100mm/s。将超声探测头置于实验大鼠胸骨前，二维超声清晰显现左室短轴切面，在乳头肌水平用M型超声记录左心室的运动曲线，测量舒张末期左室内径(LVIDd)和收缩末期左室内径(LVIDs)，FS =(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%。

1.3.3血流动力学检测：在行FS检测后当天，进行血流动力学相关的心功能检测。大鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后仰卧位固定，颈部备皮，正中纵行切开一个2cm的切口，暴露右颈总动脉；实行颈动脉心室内插管：将PE50导管插管到左心室，导管的另一端与压力换能器相连，用BL-420S型机能实验系统(成都泰盟)连续记录数据30 min，脱机分析心功能参数，包括：左室收缩压(LVSP)和左室收缩末压(LVEDP)。

1.3.4血清TNF-α含量检测：在进行血流动力学检测同时，待10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉腹腔注射后，心尖部针刺抽取血液约5ml，离心3 000r/min×15min，分离血清，保存于-80℃冰箱备用。根据ELISA试剂盒(Biovision, K1052-100)进行TNF-α含量检测。严格按试剂盒说明书步骤操作，使用酶标仪记录450nm处的吸光度值。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 两组大鼠一般状态及IMR变化

模型组中有一只大鼠在造模2天后死亡，其余大鼠身体逐渐恢复。此过程中两组大鼠的一般状态无明显差别：体形均由偏瘦到恢复正常、毛发均由无光泽到有光泽、行动均由迟缓到正常。2周后模型组IMR指数较对照组明显增加(32.21±4.17 vs 15.67±3.21,t=4.21,P<0.05)。

2.2 两组大鼠心泵功能变化

与对照组比较，模型组大鼠FS明显降低(P<0.05)， LVSP显著降低(P<0.01)，而LVEDP显著升高(P<0.01)，见表1。

表1 两组大鼠心泵功能比较

注：与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 两组大鼠血清TNF-α含量变化

与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α的含量显著升高(63.49±5.43pg/ml vs 283.00±9.44pg/ml,t=5.73,P<0.01)。

2.4 血清TNF-α与心肌微循环障碍大鼠心功能变化的关系

模型组大鼠中，高炎组FS和LVSP较低炎组均明显降低(P<0.05或P<0.01)，而LVEDP较低炎组显著升高(P<0.05)。

表3 高炎组与低炎组大鼠心泵功能比较

注：与低炎组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

心肌梗死是目前严重危害患者生命的重要疾病之一[10,11]。研究报道，冠脉微循环障碍是心肌梗死的重要死亡原因[12]。因此，针对微循环障碍所引起的心功能损伤对于最终防治心肌梗死具有至关重要的意义。

本研究运用自体血栓法建造大鼠冠脉微循环模型，探讨微循环障碍对心功能损伤的作用，以及其可能机制是否与炎性因子TNF-α有关。IMR是近年来用来评价微循环障碍较新颖的指标[13,14]，本文中，造模2周后模型组IMR指数较对照组明显增加，而两组大鼠体形、毛发、行动等一般情况无显著差异，提示造模成功。

FS、LVSP、LVEDP是检测心功能的重要指标，本研究发现模型组与对照组相比，FS和LVSP均显著降低，而LVEDP显著升高，表明冠脉微循环障碍可严重损害心功能。这与Petra等[15]和Vasiljevic等[16]研究发现一致。而冠脉微循环障碍引起心功能受损的机制尚不清楚。

心血管疾病是一种炎症相关性疾病，不同炎性因子在心血管疾病的发展中起关键作用。先前的研究已证实，炎性因子是该病的潜在机制，它可作为预测标志物用以防治心血管并发症的靶标[17,18]。重要的是，TNF-α被报道与心肌梗死和微循环障碍均密切相关[19,20]。因此，本研究比较了两组大鼠TNF-α含量，发现与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α含量显著升高。提示TNF-α可能参与了冠脉微循环障碍引起的心功能受损这一病理过程。

为了明确炎性因子TNF-α与微循环障碍大鼠心功能损伤的关系，本研究进一步将模型组按TNF-α含量分为高炎组和低炎组。结果发现与低炎组比较，高炎组大鼠FS和LVSP均明显降低，而LVEDP明显升高。提示炎性因子TNF-α可加重微循环障碍大鼠的心功能损伤。这与Benneta等[21]的研究结果一致。

综上，本研究发现冠脉微循环障碍大鼠心功能严重受损，并且这种损伤与炎性因子TNF-α水平升高有关。为了进一步验证该结论，本实验组下一步将利用siRNA干扰TNF-α，深入探讨沉默炎性因子TNF-α对冠脉微循环障碍大鼠心功能的影响，为心肌梗死的防治提供重要的实验与理论支撑。

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