三叶草作为Sr、Cs污染指示植物的效应研究

陈 敏，王 丹，闵可怜，湛晓蝶，刘 玲

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621000；2.西南科技大学核废物与环境安全国防重点实验室，四川 绵阳 621000）

【研究意义】核素90Sr、137Cs是核裂变反应的主要放射性产物，核试验、核事故和核武器的使用等导致核素90Sr、137Cs大量释放到环境中，大气中的放射性核素污染物随降水进入土壤环境［1］。90Sr、137Cs半衰期较长，进入环境很难清除，容易通过食物链进入人体，对人体产生危害［2］。目前对土壤核素污染的监测方法主要是取样检测法［3］，这种监测方式工作量大，监测成本高且不具有长期性和连续性。在实际应用中多采用生物监测与理化监测相结合的方式，可以真实有效全面反映污染对环境的危害。早在1987年我国就开始了生物监测工作，在水体、土壤、大气等领域开展生物监测并取得了多方面的应用成果［4］。随着我国加大对核资源的开发利用，造成核废弃物、废渣的产生，无疑增加了环境放射性污染的可能性［5-6］。因此，做好核素污染监测和防治是一项势在必行的工作，具有一定的前瞻性。

【前人研究进展】当环境发生改变时，生物针对环境变化做出适应性改变，植物对不同胁迫产生的特征反应，对环境有直接或间接的指示作用。核素和重金属等胁迫在植物个体水平、细胞水平、分子水平各级产生影响［7-9］；对植物的营养生长有抑制作用，使植物外观表现出病态特征［10］；对植物的生殖生长产生影响，影响植物开花结果等［11-14］。研究Sr、Cs对植物生长发育的影响，以期从众多植物中寻找到敏感植物，为土壤核素Sr、Cs污染的生物监测打下良好基础。

【本研究切入点】目前已有大量关于生物监测的研究报道，主要在大气和水体污染方面取得了良好效果。由于土壤环境的复杂情况，鲜有针对土壤核素Sr、Cs污染，利用高等植物作为指示植物的研究。有研究发现，三叶草对大气污染敏感［15］，有作为敏感植物的特征。同时，在植物修复领域，豆科植物对重金属污染更为敏感，三叶草是豆科植物中很受欢迎的研究材料，对重金属具有较强的转运能力［16-17］。其生长快速，用途广泛，常被用作草坪绿植，牧草、绿肥等，具有很大的实际应用价值。【拟解决的关键问题】本研究选取豆科植物三叶草作为试验材料，参照前人研究设置极低处理浓度，在环境条件更单一的水培环境中，分别研究Sr、Cs和Sr+Cs处理对植物生长和生理生化的影响，对以高等植物作为土壤污染指示植物进行初探。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为三叶草（Trifolium pratenseL.），种子购于江苏省宿迁市辉煌花木院。供试试剂SrCl2·6H2O和CsCl购于绵阳市信捷商贸有限责任公司。

1.2 试验方法

试验于2018年10月26日至2019年1月在西南科技大学温室进行。三叶草种子在育苗盆中用河沙∶珍珠岩=3∶1基质育苗，待植株生长到4片真叶时进行移栽。试验采取盆栽水培方法，每盆（长43.5 cm×宽20 cm×高14 cm）加入Hogland营养液5 L（营养液参照张晓雪等［18］的方法进行配制，用1 mol/L NaOH溶液调制pH 6.0）。纯营养液培养7 d，待三叶草适应水培环境后，更换营养液并一次性添加SrCl2·6H2O和CsCl溶液。试验设3种处理，每种处理设置4个水平，分别为0.1、0.5、1、2 mg/L，Sr处理分别表示为Sr 0.1、Sr 0.5、Sr 1.0、Sr 2.0，Cs处理分别表示为Cs 0.1、Cs 0.5、Cs 1.0、Cs 2.0，Sr+Cs（1∶1）处理分别表示为（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）0.5、（Sr+Cs）1.0、（Sr+Cs）2.0，以只含营养液的空白处理作对照（CK）。每个处理3次重复，每个重复1盆，共39盆，每盆定植10株，共390株。每隔1 d向盆中打入等量空气，补充氧气，同时观察记录三叶草生长情况。每隔10 d向盆中补充营养液，保证三叶草正常生长。

1.3 测定指标及方法

盆栽培养45 d统计三叶草植株冠径、叶面积、单株黄叶率等生长指标。培养50 d，每盆收获8株三叶草，剪取植物叶片鲜样保存测定相关生理生化指标。用电子天平称量鲜重后烘干至恒重称取干重。

1.3.1 三叶草生理生化指标测定 用硫代巴比妥酸（TBA）加热比色法［19］测定植物叶片丙二醛（MDA）含量，用95%乙醇浸提比色法［20］测定叶片叶绿素含量；在整个培养过程中，每隔1 d观察记录1次三叶草生长状况，在试验处理后50 d统计各项生长指标。

1.3.2 植株Sr、Cs含量测定 将植物烘干样品研磨成粉末，称取0.5 g，加入10 mL硝酸（分析纯）、5 mL高氯酸（分析纯）于消解炉上消解至透明，然后每30 min赶酸1次，待酸雾赶尽冷却后定容至10 mL，采用火焰原子吸收光谱法［21］测定样品Sr、Cs含量。

试验数据采用采用Microsoft Excel 2007和SPSS 25.0软件进行处理和单因素方差分析及多重比较。图表采用Origin 9.0绘制。

2 结果与分析

2.1 Sr、Cs、Sr+Cs处理对三叶草生长的影响

2.1.1 不同处理对三叶草各生长指标的影响 由表1可知，Sr处理对三叶草单株叶面积有显著促进作用，且随处理浓度的升高呈下降趋势，其中Sr0.1处理的叶面积比对照高8.6%，其余生长指标与对照无显著差异。Cs处理对三叶草植株冠径、单株叶面积、地上部鲜重均有显著抑制作用，表现为Cs0.1、Cs0.5、Cs1.0、Cs2.0处理植株冠径比对照分别低35.0%、25.0%、34.9%、28.0%，单株叶面积比对照分别低31.6%、32.4%、38.2%、41.7%，地上部鲜重比对照分别低46.2%、42.7%、41.7%、48.0%； Cs2.0处理三叶草地部鲜重显著低于对照33.8%，其余Cs处理三叶草地下部鲜重与对照无显著差异，说明较低浓度Cs处理对三叶草地下部生长影响不大。Sr+Cs处理三叶草各项生长指标均显著低于对照，表现为（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）0.5、（Sr+Cs）1.0、（Sr+Cs）2.0处理植株冠径比对照分别低31.6%、37.1%、29.5%、34.8%，单株叶面积比对照分别低16.8%、17.4%、19.4%、21.1%，地上部鲜重比对照分别低47%、51.6%、52.4%、59.9%，地下部鲜重比对照分别低26.2%、41.6%、43.9%、47.8%，表明Sr+Cs复合处理对三叶草地下部生长抑制作用更强。

表1 Sr、Cs和Sr+Cs不同处理对三叶草各生长指标的影响Table 1 Effects of Sr, Cs and Sr+Cs treatments on the growth indicators of clover

2.1.2 不同处理三叶草叶片黄化表现 三叶草经Sr、Cs和Sr+Cs处理后的前15 d生长缓慢，未观察到黄化叶片。处理后17 d，首先在Cs 2.0处理发现三叶草叶片表现异常（图1 A），少数叶片出现边缘黄化；在之后的观察中发现，Cs处理和Sr+Cs处理的三叶草叶片陆续出现此现象，图1B～D为叶片黄化过程，叶片黄化从边缘开始，逐渐向叶片中心蔓延，最终整个叶片黄化坏死。从整株来看，叶片黄化从植株底部老叶开始向生长点发展，严重的植株出现大量叶片黄化，但没有植株彻底死亡。处理后45 d统计的三叶草单株黄叶率如图2所示，可以看出Sr处理各浓度间三叶草单株黄叶率与对照无显著差异；Cs和Sr+Cs处理下三叶草单株黄叶率随处理浓度升高而逐渐上升，最高分别为38.2%、39.9%，在浓度大于0.5 mg/L时Sr+Cs处理下黄叶率大于Cs处理，说明当Sr、Cs复合处理对三叶草生长影响更大。

图1 三叶草生长过程中叶片黄化表现Fig.1 Leaf yellowing performance in the growth of clover

图2 三叶草单株黄叶率Fig.2 Yellow leaf rate of per plant of clover

2.1.3 不同处理对三叶草生物量的影响 植物生物量变化可以直接表明重金属对植物生长的影响。如图3所示，比较3种处理三叶草地上部干质量的大小关系可知，Sr处理下，仅Sr2.0处理地上部干质量显著低于对照；Cs处理和Sr+Cs处理下，地上部干质量均显著低于对照，以Cs2.0和（Sr+Cs）1.0处理的干质量最低，比对照分别低48%和56%。比较3种处理三叶草地下部干质量的大小关系可知，仅Sr+Cs处理的地下部干质量显著低于对照，以（Sr+Cs）1.0处理的干质量最低，比对照低44%。综上所述，Sr+Cs处理对三叶草的抑制作用最显著，其次为Cs处理，Sr处理对三叶草生长的影响较小。

图3 三叶草植株地上部、地下部生物量Fig.3 Average shoot and root biomass of per plant of clover

2.2 Sr、Cs和Sr+Cs处理对三叶草生理生化的影响

2.2.1 不同处理对三叶草叶片MDA含量的影响 MDA是植物膜脂过氧化产物，其含量间接反映植物膜脂过氧化程度和植物所受的逆境胁迫。由图4可知，三叶草叶片MDA含量在3种处理下均随处理浓度升高而逐渐增加，其中Sr处理浓度1.0 mg/L、Cs 处理浓度0.5 mg/L、Sr+Cs处理浓度1.0 mg/L时，三叶草叶片MDA含量显著高于对照，说明三叶草叶片MDA含量对Cs处理浓度更敏感；Cs 2.0处理三叶草叶片MDA含量最高达35.06 nmol/g，为对照的2.06倍，而（Sr+Cs）0.1处理下三叶草叶片MDA含量低于对照，随后逐渐升高且显著高于对照。综上所述，三叶草叶片膜脂过氧化程度随处理浓度升高而逐渐加重。

图4 三叶草叶片MDA含量比较Fig.4 Comparison of MDA contents in leaves of clover

2.2.2 不同处理对三叶草叶片叶绿素含量的影响 植物叶绿素含量直接影响植物光合作用，与植物营养生长和叶片黄化密切相关。由图5可知，Sr处理三叶草叶片叶绿素含量随处理浓度升高逐渐降低，与对照差异不显著；Cs 0.1、Cs 0.5、Cs 2.0处理三叶草叶片叶绿素总含量显著低于对照，比对照分别低40%、53%、43%；（Sr+Cs）0.1、（Sr+Cs）1.0处理叶片叶绿素总含量显著低于对照，比对照分别低32%、35%。综上结果表明，Cs处理和Sr+Cs处理三叶草叶片叶绿素合成受到显著抑制，植株形态发生明显变化，叶面积减小，叶片黄化数量增多。

图5 三叶草叶片叶绿素总含量比较Fig.5 Comparison of chlorophyll contents in leaves of clover

2.3 三叶草植株对Sr、Cs吸收情况比较

由图6A可知，三叶草地上部和地下部Sr含量均随Sr处理浓度的升高而显著升高，其地上部Sr含量在0.49～1.89 mg/kg之间，地下部Sr含量在0.31～1.13 mg/kg之间，在Sr处理浓度2.0 mg/L时植株Sr含量达到最高，且表现为地上部＞地下部，表明三叶草对Sr有一定的转运能力。由图6 B可知，三叶草地上部和地下部Cs含量均随Cs处理浓度的升高而显著升高，其地上部Cs含量在1.80～14.54 mg/kg之间，地下部Cs含量在1.65～11.25 mg/kg之间，在Cs处理浓度2.0 mg/L时植株Cs含量达到最高。在单一Cs处理浓度超过0.1 mg/kg时，三叶草地上部Cs含量高于地下部；Sr+Cs处理三叶草地上部Cs含量高于地下部，说明三叶草对Cs具有较强的转运能力。比较图6A与图6B，在同一浓度Sr+Cs处理下，三叶草对Cs有更强的积累能力，其地上部和地下部Cs含量远远大于Sr含量。综上所述，三叶草对Sr的积累量较低，对三叶草生长的影响较小，对Cs积累量较高，使三叶草生长受到影响，且表现出受胁迫特征。

3 讨论

对土壤Sr、Cs污染的研究主要针对植物修复方面，研究者往往重点关注植物对Sr和Cs耐受性、生物量大小、吸收能力以及转运能力等，以期筛选出超富集植物。本研究中，参照前人［18,22-23］研究的基础，设置了比以往研究更低的浓度，表现出Cs处理比Sr处理对三叶草生长抑制作用更大。唐永金等［24］研究在高浓度Sr、Cs（500 mg/kg）处理下，Sr处理植物生长更好。有研究表明，低浓度Sr处理对植物生长有促进作用，高浓度Sr抑制植物生长［25］。本研究中，Sr处理对三叶草生长无显著影响，但其单株叶面积显著增加，可能是由于三叶草对Sr的吸收量较小且三叶草对Sr不敏感，因此与对照无显著差异。洪晓曦等［26］研究发现，低浓度Cs处理对油菜生长发育有促进作用，而高浓度Cs处理油菜生长受到抑制，株高、生物量、叶绿素含量、POD活性都呈下降趋势。本研究中，添加Cs的处理浓度较低，但Cs处理和Sr+Cs处理对三叶草的生长具有抑制作用，表现为植株冠径、单株叶面积、植株鲜重和叶绿素含量等均显著低于对照，表明三叶草对Cs处理较为敏感。

本研究结果表明，三叶草叶片MDA含量随3种处理浓度的升高呈显著上升的趋势，与安冰等［22］、储玲等［27］的研究结果一致。这表明Sr处理对三叶草的影响首先表现在生理水平，其生长表现与对照无显著差异，可能原因是三叶草对Sr的吸收量还不足以打破三叶草生理平衡以及三叶草对Sr、Cs的响应程度不同。在Cs处理和Sr+Cs处理下，三叶草无论是在生理水平和个体水平均表现出胁迫反应，进一步表明三叶草对Cs的敏感性。有研究表明，重金属胁迫会影响植物叶绿素的合成，进而影响植物光合作用合成有机物，使植物生长受到抑制，表现出黄叶现象［28］。本研究中，Sr处理三叶草的生长与对照无显著差异，且其叶片叶绿素含量与对照亦无显著差异，这与多数低Sr促进叶绿素形成的研究结果存在差异［29］，其原因可能为不同植株对Sr的抗逆性存在明显差异。然而，Cs处理和Sr+Cs处理，三叶草叶片明显黄化，且叶片叶绿素含量显著低于对照，这与武慧斌［30］研究中Cs处理红三叶草叶绿素含量降低的结果一致。

不同植物对Sr、Cs的吸收能力不同，有的植物对Cs的吸收能力大于对Sr的吸收能力［18,31］，有的植物则相反［23］，但均表现为植物体内Sr、Cs含量随处理浓度的升高而升高［22,24,32］。本研究3种处理下三叶草对Cs的吸收能力均强于对Sr的吸收能力，两种元素的含量均随处理浓度的升高而逐渐升高。有研究报道，Sr和Ca具有相似化学性质，Ca的存在会降低植物对Sr的吸收［33］，试验所用营养液Ca离子丰富，这可能是三叶草对Sr吸收量较小的原因。三叶草地上部Cs含量也大于其地下部，Hampton等［34］、White等［35］、Qi等［36］报道的Cs毒性机理表明，植物对K和Cs的吸收依赖同一载体，二者具有竞争关系。杨俊诚等［37］研究表明，在Cs污染的土壤中施加K可有效减少植株对Cs的吸收。此外，植物在缺少K元素时叶片也会表现出叶缘呈黄色或赤褐色焦枯［38］，还会表现出叶绿素含量下降和叶面积减小等特征［39］。本研究中，Cs处理和Sr+Cs处理三叶草叶片黄化特征明显，从叶片边缘黄化至整个叶片，此现象与植物缺钾症状极为相似，且三叶草对Cs有较强的吸收和转运能力。这可能是由于Cs存在时，Cs元素竞争性占用了K元素的转运蛋白，抑制了三叶草对K元素的吸收，最终导致三叶草叶片出现缺钾症状。研究表明，Sr和Cs相互影响、相互抑制植物对Sr和Cs的吸收［40］，当Sr、Cs复合处理后，植物对Sr、Cs的积累量均小于单一Sr、Cs处理，这与本研究结果一致。由于水培环境与土壤环境存在很大差异，水培结果不能完全代表土壤污染情况，需进一步进行土培验证，探究三叶草对Cs的敏感性，并且在之后的研究中应注意Sr与Ca、Cs与K元素之间的相互影响，进一步探究植物对Sr、Cs的敏感机理。

4 结论

本试验结果表明，Sr、Cs和Sr+Cs处理三叶草生长情况存在差异，其中Sr处理对三叶草生长无显著影响，而Cs处理和Sr+Cs处理对三叶草产生了一定程度的毒害作用，导致三叶草叶绿素含量显著降低，叶面积减小，生物量降低，叶片黄化，膜脂过氧化程度加重，表明三叶草对Cs较为敏感，具有作为Cs污染土壤指示植物的潜力。Cs处理三叶草个体水平表现出特异性特征，即三叶草叶片边缘出现褐色斑点，在叶片边缘形成一圈黄色干枯，并逐渐向叶片中心发展，直至整个叶片黄化干枯，此现象可能成为三叶草对Cs污染土壤的指示特征。