熊去氧胆酸联合骨化三醇治疗原发性胆汁性肝硬化患者疗效和外周血T淋巴细胞亚群的变化*

贾 娇，王 芳，张 波，武 琼

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种自身免疫机制介导的慢性肝内胆汁淤积性疾病[1，2]。若治疗不及时容易进展至肝衰竭。PBC患病人群以中老年妇女较多见[3]。临床主要应用熊去氧胆酸(UCDA)治疗PBC患者。临床应用经验显示UDCA能够有效改善患者肝功能[4]，但单一使用UDCA对某些患者毫无治疗效果。近年来，越来越多的研究发现人体维生素D水平与慢性乙型肝炎、丙型肝炎发病有关，补充维生素D可提高抗病毒效果。骨化三醇作为维生素D中最活跃的1，25-二羟代谢物[5]，是人体最重要的钙调节激素之一，通过其相应的受体(vitamin D receptor, VDR)介导而发挥作用[6]。近年来的研究发现骨化三醇不仅具有多种重要的免疫调节功能[7]，而且其受体VDR的基因多态性与包括自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化症、2型糖尿病在内的多种自身免疫性疾病存在基因连锁[8]，而PBC的发病为自身免疫机制紊乱介导，补充骨化三醇可能通过免疫调节而对PBC起到治疗作用。本研究采用UCDA联合骨化三醇治疗了PBC患者，取得了很好的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年6月～2018年6月我院消化内科治疗的PBC患者100例，男27例，女73例；年龄范围为46～68岁，平均年龄为(53.3±12.1)岁；病程1.3～3.0年，平均为(2.3±1.6)年。诊断依据美国肝脏病学会和欧洲肝脏病学会提出的诊疗指南[10]，抗线粒体抗体(AMA)阳性，无严重的心、肾器官疾病，对本研究应用药物无过敏反应。根据Child-Pugh分级标准[9]，其中A级32例，B级41例，C级27例；有黄疸42例，肝肿大31例，脾肿大17例，腹水20例，腹泻14例。排除标准：①肝内外胆管梗阻性疾病和和恶性肿瘤；②药物性肝损伤或病毒性肝炎；③孕妇和哺乳期妇女；④入组前半个月内使用过免疫调节药物或糖皮质激素。采用随机数字表法将患者分成对照组50例和观察组50例，两组年龄、性别、病程和病情等资料比较，差异无显著性(P>0.05)，具有可比性。患者签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 治疗方法 给予所有PBC患者UCDA(德国Losan Pharma GmbH公司，批准文号： H20150365)13～15 mg.kg-1.d-1或者250 mg口服，3次/d；观察组在此基础上给予骨化三醇胶丸【正大制药(青岛)有限公司，国药准字: H20143141】0.5～1.0 μg口服，1次/d，持续用药1年。

1.3 检测 使用C16000全自动生化分析仪检测血生化指标；使用美国 Roche E- 602 全自动免疫分析仪及其配套试剂检测血清25羟维生素D3【25-hydroxyvitamin D3, 25(OH)D3】；使用美国 BD公司生产的 FACS Calibur 流式细胞仪检测外周血 CD4+、辅助T细胞17(T helper cell 17, Th17) 细胞百分比；采用化学比色法检测血清二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO, 上海抚生实业有限公司)；采用改良酶学分光光度法检测血清D-乳酸(武汉艾美捷科技有限公司)；采用鲎试剂检测血清内毒素(美国ACC公司)。

1.4 UDCA应答判定 参考巴塞罗那标准，经UDCA标准治疗1年后，血清ALP水平下降超过40%或下降到正常水平。

2 结果

2.1 两组应答率比较 在治疗1年末，观察组应答36例(72.0%)，显著高于对照组的26例(52.0%，P<0.05)。

2.2两组血生化指标变化的比较 在治疗前，两组患者血清ALT、AST、ALP、GGT和TBA水平均无显著性差异(P>0.05)；在治疗1年结束时，观察组血清ALP、GGT和TBA水平显著低于对照组(P<0.05，表1)。

表1 两组血生化指标比较

与对照组比，①P<0.05

2.3 两组血清25-(OH)2-D3和外周血T细胞亚群比较 在治疗前，两组血清25-(OH)2-D3和外周血CD4+和Th17细胞百分比均无显著性差异(P>0.05)；在治疗1年结束时，观察组血清25-(OH)2-D3和CD4+细胞百分比显著高于对照组(P<0.05)，Th17细胞百分比显著低于对照组(P<0.05，表2)。

2.4 两组肠道屏障功能比较 治疗前，两组肠道屏障功能指标无显著性差异(P>0.05)；治疗后，观察组血清DAO、D-乳酸和内毒素水平显著低于对照组(P<0.05，表3)。

表2 两组血清25-(OH)2-D3和外周血T细胞亚群比较

与对照组比，①P<0.05

表3 两组血清肠道屏障功能指标比较

与对照组比，①P<0.05

3 讨论

UCDA能在疾病的早期改善血清生化指标[12]，减轻肝组织学病变。另外，根据多项研究显示，骨化三醇也与机体的免疫性肝病有密切的联系[13-15]，其与疾病程度、肝组织损伤和并发症都有极大的相关性。

本研究发现，观察组应答率显著高于对照组，说明在UCDA结合骨化三醇的治疗下，血清ALP水平下降。血清GGT主要来源于肝脏，在正常情况下由于其分子量大而不能透过肝细胞膜，因此血清含量极低。 当胆管细胞损伤时，细胞膜通透性增加，GGT由细胞内进入血液，导致血清GGT水平升高。研究报道[16]，GGT活性与肝脏疾病炎症程度有良好的一致性，可作为反映胆管细胞损伤的指标。本研究结果显示，治疗后两组患者血清GGT水平呈降低趋势，表明治疗的有效性。在经过UCDA联合骨化三醇治疗后，能够有效地改善PBC患者的肝部受损情况。相关研究显示，PBC的发生与感染有关。一般情况下，胆管在各种防御机制下，处于无菌环境，而抗菌肽在维持无菌环境中起着重要的作用。UDCA联合骨化三醇治疗能提高抗菌肽表达，可以提高胆管性疾病的治疗效果，减轻炎性损害。

多项研究表明骨化三醇与肝纤维化或部分免疫性肝病有关[17]。骨化三醇能明显减轻四氯化碳所致的肝组织损伤，抑制肝纤维化发展。本研究也发现血清25-(OH)2-D3和外周血CD4+T淋巴细胞百分比在治疗后都发生了明显的变化。T淋巴细胞减少，会影响免疫耐受性，导致针对胆管上皮细胞线粒体内膜上的自身抗原，诱发抗线粒体(AMA)的大量生成与释放，其与线粒体抗原结合后可破坏靶细胞的新陈代谢，诱导细胞功能紊乱，最终形成组织损伤。本研究发现，治疗后观察组Th17、25-(OH)2-D3和CD4+细胞百分比有显著的变化。PBC为自身免疫性疾病，PBC的致损伤机制与免疫系统功能紊乱有关。骨化三醇在PBC患者的治疗过程中发挥着重要的作用。研究发现PBC患者胆管上皮细胞表达HLA II类分子上调，后者能激活T淋巴细胞，从而启动适应性免疫反应，其中激活T细胞的主要是CD4+细胞，在PBC患者胆管损害过程中发挥着重要的作用[18]。维生素D的活性形式骨化三醇具有抑制人单核巨噬细胞上HLA II类分子表达作用，从而可以通过减少T细胞活化而减轻适应性免疫对组织的损伤。结合本研究发现，我们认为PBC 患者存在免疫功能失衡，25-(OH)2-D3直接影响了 CD4+Treg细胞数，加用骨化三醇治疗可能提高了 PBC患者的免疫活性细胞数量。

根据本研究数据可知，观察组血清DAO、D-乳酸和内毒素水平显著低于对照组。血浆DAO、D-乳酸和内毒素可用于肠黏膜屏障功能的监测[19]。正常的肠粘膜屏障对于维持肝脏乃至全身系统的稳定至关重要。PBC系自身免疫介导的慢性肝脏疾病。肠道与肝脏通过门脉联系在一起，肠道来源的血液经门静脉进入肝脏，而肝脏主要的血供就来源于门静脉，其中包含肠道来源的食物抗原、细菌产物和毒素，需要肝脏的清除。当肠道粘膜屏障受损时，大量细菌毒素通过门静脉进入肝脏，免疫细胞被内毒素激活产生一系列的炎症级联反应，加重肝损伤。因此，在对患者治疗方面，我们应当重视对肠粘膜屏障功能的保护。抑菌肽在维持肠道菌群平衡中起着保护肠道的作用，可通过与黏膜表面细菌相互作用，使内皮细胞等免受细菌侵害。由于VDR激活是内皮细胞表达抑菌肽的先决条件，因而VDR在黏膜屏障平衡中扮演关键角色。骨化三醇缺乏可能危害黏膜屏障功能，导致黏膜损伤风险加大，一旦抗原侵入机体，骨化三醇可调节黏膜表面菌群，抑制肠腔细菌黏附。调整紧密连接蛋白，维持黏膜屏障完整性，抑制致病菌入侵及移位、调整免疫反应等肠道发病的各个环节。因而骨化三醇在维持肠道菌群平衡中具有重要的作用，可调控固有免疫和适应性免疫应答反应。患者接受了UDCA联合骨化三醇治疗后，血清DAO、D-乳酸、内毒素都得到了显著的降低，显示患者的肠粘膜屏障功能得到了更有效的恢复[20]。