常见血红蛋白变异体对离子交换高效液相色谱法检测糖化血红蛋白的影响＊

潘少霞，陈冬莲，刘艳晨，章青英，陈晓英，刘首明

（广东省清远市中医院检验中心，清远511500）

糖化血红蛋白（HemoglobinA1c，HbA1c）是临床评价糖尿病患者长期血糖控制的常用生化指标[1-4]。已知，血红蛋白病和地中海贫血等血液系统疾病对多种HbA1c检测方法（免疫抑制比浊和亲和层析法等）构成不同程度的干扰[5,6]。广东省清远市是血红蛋白病和地中海贫血等血液系统疾病的高发地区，以Hb E、Hb G-Taipei、Hb Newyork及Hb J-Bangkok等β链上的异常血红蛋白类型为主[7-9]。目前，本地区常见血红蛋白变异体对IE-HPLC检测HbA1c的干扰尚未明确，容易被临床医生和患者忽视。为此，广东清远中医院开展本项检测，旨在探讨常见血红蛋白变异体对IE-HPLC检测HbA1c的干扰程度和干扰因素，为IE-HPLC检测HbA1c提供明确的警告提示信息，确保HbA1c的实验室检查能准确可靠地服务于临床。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017年1月-2019年6月广东清远市中医院二型糖尿病患者行IEHPLC测定HbA1c的水平、已糖激酶法测定血浆葡萄糖的水平、毛细管电泳法分析血红蛋白性质和双脱氧链终止法进行血红蛋白基因测序的40例体检者的诊断学资料。其中，性别：男20例，女20例；年龄26～67周岁，平均（52.86±5.34）周岁；疾病类型：2型糖尿病患者30例，妊娠期糖尿病10例。纳入标准：具有完整病历资料；IE-HPLC检测HbA1c图谱出现变异峰。排除标准：血液系统疾病患者；近期服用过保泰松及阿司匹林等具有骨髓抑制作用的药物的人群。

1.2 方法 抽取受试者清晨空腹状态下的肘静脉血4 ml，置于生化分离管当中，以3000r/min转速对血液标本进行5min的离心，静置后分离血清，放置在-80℃血清储存箱中保存，待检。采用对离子交换高效液相色谱法（IE-HPLC）测定HbA1c的水平，仪器为全自动HbA1c分析仪（生产单位：美国伯乐公司，型号：BIO-RAD VAKIANTⅡ），糖化血红蛋白AIC试剂盒购自美国伯乐生物科技有限公司；采用葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖的水平，仪器为全自动生化分析仪（生产单位：贝克曼库尔特商贸有限公司，型号：BECKMAN COULTER AU5800），试剂盒购自美康生物科技股份有限公司；采用毛细管电泳法分析血红蛋白性质，仪器为全自动毛细管蛋白电泳分析仪（生产单位：海伦娜生物科技公司，型号：V8），试剂盒购海伦娜生物科技公司；采用双脱氧链终止法进行血红蛋白基因测序，交广州金域检验实验室进行实验。所有试验操作严格按照试验说明书及实验室标准操作进行。

1.3 统计学方法 所有数据均经SPSS 20.00统计学软件进行统计学处理，采用描述性统计分析，实验数据进行直线偏差百分比分析。

2 结果

2.1 表型结果 40例体检者HbA1c测定结果与血糖检测结果均出现明显偏差，均超出IE-HPLC的定量分析范围，详见表1。检测图谱显示：40例体检者的检测图谱均出现变异峰；序号1、3及6体检者，HbA和HbA1c出峰时间提前；序号4及7体检者，HbA1c出峰时间滞后，变异峰分别占总面积53.74%、55.16%；序号8体检者，HbA1c出现变异峰，占总面积92.34%，具体见表1。

表1 体检者表型检测结果

2.2 毛细管蛋白电泳结果 毛细管蛋白电泳结果显示，40例体检者均出现的异常血红蛋白区带。检测图谱显示：序号1、3及6体检者，HbA变异峰分别占总面积1.56%、1.08%和2.49%，HbA2变异峰分别占总面积5.01%、5.91%和7.91%，HbA1c变异峰分别占总面积1.04%、1.22%和2.07%；序号2及5体检者，HbA变异峰分别占总面积40.76%和40.70%，HbA2变异峰分别占总面积2.66%和2.77%，HbA1c变异峰分别占总面积1.95%和2.35%；序号4及7体检者，HbA变异峰分别占总面积70.18%和70.27%，HbA2变异峰分别占总面积3.59%和3.69%，HbA1c变异峰分别占总面积21.82%和27.25%；序号8体检者，HbA变异峰占总面积50.38%，HbA2变异峰占总面积3.01%，HbA1c变异峰占总面积62.99%，具体见表2。

表2 毛细管蛋白电泳结果

2.3 基因测序结果 基因测序结果显示，40例体检者的血红蛋白β链均发生突变基因，详见表3。

3 讨论

HbA1c是血清中的糖类与红细胞中的血红蛋白相结合化合物，其反应过程缓慢、持续且不可逆，能够反映了红细胞生命周期内的平均血糖水平[10]。由于，血红蛋白变异体广泛出现在血红蛋白病和地中海贫血等血液系统疾病，而正常血红蛋白与异常血红蛋白的理化性质存在差异[11]。IEHPLC检测HbA1c的工作原理决定了其有可能被血红蛋白变异体干扰，导致HbA1c测定结果存在过大偏倚。若HbA1c测定结果存在过大偏倚会误导临床对疾病的评估和治疗，不利于改善患者预后，甚至增加医疗不良事件的风险[12]。因此，了解本地区常见血红蛋白变异体对IE-HPLC检测HbA1c是否存在干扰及其干扰程度和干扰因素，有助于提高HbA1c的实验室检查的准确性。

表型结果显示，本组40例体检者HbA1c测定结果与血糖检测结果均出现明显偏差，均超出IEHPLC的定量分析范围。毛细管蛋白电泳结果显示,本组40例体检者均出现的异常血红蛋白区带，其变异峰有不同的表达。提示，本组40例体检者均存在血红蛋白变异体,血红蛋白变异体对IE-HPLC检测HbA1c构成不同程度干扰。基因测序结果进一步显示，本组40例体检者的血红蛋白β链均发生突变基因，突变点位有GGC→GAC、GAG→AAG和GAA→GGA，血红蛋白基因型有β41-42/βJBangkok、βN/βJ-Bangkok、βN/βE和βN/βG-Taipe。与温冬梅等[13]研究者报道结果一致，提示Hb E、Hb G-Taipei、Hb Newyork及Hb J-Bangkok等血红蛋白变异体对IE-HPLC检测HbA1c构成不同程度干扰。

表3 基因测序结果

IE-HPLC测定HbA1c受到血红蛋白变异体干扰的可能机制为：⑴序号1、3及6体检者的血红蛋白基因型均为β41-42/βJ-Bangkok，HbA1c测定结果偏低可能是因为珠蛋白链Gly替换为Asp，变异体的糖化速率低于HbA的糖化速率，HbA1c又作为变异体糖化产物,导致变异体糖化产物不能准确反映血糖水平；HbA和HbA1c出峰时间提前可能是因为珠蛋白链Gly替换为Asp，增加了负电荷的数量[14]。⑵序号2及5体检者的血红蛋白基因型均为βN/βJ-Bangkok，由于β41-42/βJ-Bangkok与βN/βJ-Bangkok理化性质类似，因此其HbA1c测定结果偏低的可能机制与β41-42/βJ-Bangkok一致[15]。⑶序号4及7体检者的血红蛋白基因型均为βN/βE，HbA1c测定结果假性增高可能是因为Glu替换为Lvs，HbA1c出峰时间滞后,导致HbA被误读为Variant Window峰，Hb E被误读为HbA[16]。⑷序号8体检者的血红蛋白基因型为βN/βGTaipe，HbA1c测定结果假性增高可能是因为Glu替换为Gly，杂合子的峰形不能完全分离，未能正确读取HbA[17,18]。

综上所述,本研究探讨了常见血红蛋白变异体对IE-HPLC检测HbA1c的干扰程度和干扰因素；本地区作为血红蛋白病和地中海贫血等血液系统疾病的高发地区，选择IE-HPLC检测HbA1c时应更为谨慎；对于血红蛋白病和地中海贫血等血液系统疾病可选择果糖胺和（或）糖化血清蛋白等指标代替HbA1c评估患者的血糖水平。