胰腺癌患者外周血sPD-L1的表达水平及其与免疫功能的相关性分析

韩 瑞，张建业，祁生福，韩玉成

胰腺癌作为恶性程度较高的癌症，其肿瘤细胞有较强组织浸润和远处转移倾向，且由于早期缺乏典型的临床症状，其诊断率多年来持续偏低，80%～85%的胰腺癌患者确诊时已丧失手术切除治疗的机会[1]，由于癌症病灶缺乏血供，且纤维组织包裹，静脉注射药物难以深入病灶，故治疗效果及预后生存状态极差。目前，有关胰腺癌早期生物学行为恶化机制的研究尚未完全明确，但已有较多研究借助恶性肿瘤共有的免疫抑制或逃逸理论对其做出初步解释，认为胰腺癌细胞可通过多个信号通路导致自身免疫杀伤功能减弱，对内源性因素及外源性的化疗、靶向治疗等抗肿瘤作用均造成较大负面影响[2]。由于淋巴微转移灶及脱落的循环肿瘤细胞更易于存活逃逸，为胰腺癌的远处转移提供助益[3]。程序性死亡分子-1(PD-1)/程序死亡分子-受体1(PD-L1)通路是肿瘤分子学领域近年来的研究热点，其负性免疫调节作用已较明确，尤其明确在乳腺癌组织及间质浸润淋巴细胞中表达活跃[4]，部分西方国家也以此为据研制出单抗类生物制剂，在晚期癌症治疗中获得广泛认同[5]。可溶性程序性死亡分子-配体1(sPD-L1)是PD-L1游离在内环境的形式，与细胞膜表面mPD-L1在功能上甚为相似，然而由于外周血标本更便于临床检测，其在食管鳞状细胞癌患者肿瘤免疫微环境评估方面的临床价值获得证实[6]，但对于恶性程度更甚的胰腺癌研究仍较少。本研究旨在探析胰腺癌患者外周血sPD-L1水平与机体免疫功能的关系，取得一定成果。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2014年1月—2016年12月青海省交通医院收治的64例胰腺癌患者的临床资料。①纳入标准：所有患者的临床表现、影像学检查及细针穿刺活检结果均符合胰腺癌相关诊断标准[7]；年龄在18～80岁；临床资料及随访信息完整。②排除标准：诊断为急慢性胰腺炎、良性胰腺囊性病变或其他部位原发恶性肿瘤者；合并自身免疫性疾病、慢性炎症、结核病或活动性感染者；指标检测前已接受手术、放化疗、免疫治疗等任何抗肿瘤干预措施者；有器官移植手术史，激素或免疫抑制剂应用史。以入院时血浆sPD-L1水平中位数为界将64例胰腺癌患者分为高表达组(sPD-L1≥3.61 ng/ml)和低表达组(sPD-L1<3.61 ng/ml)，每组32例。

1.2方法 患者入院后，在空腹状态下常规抽取肘前静脉血样2个抗凝管各3 ml，其一在30 min内以4000 r/min离心15 min，提取上层血浆冻存于-80℃冰箱，统一检测时提前1 d将血浆置于4℃冰箱平衡融化，分别采用sPD-L1、干扰素-γ(IFN-γ)对应的酶联免疫吸附法试剂盒，严格按照其说明书执行加样、加抗体、温育、洗板、显色等操作，30 min内通过酶标仪读取吸光度，标准样数据绘制标准曲线，计算血浆样品中sPD-L1、IFN-γ的浓度。另一静脉血样加入CD8+、CD4+对应的荧光标记抗体混匀，经由避光冰浴、加红细胞裂解液、避光温育等步骤，以2000 r/min转速离心5 min，弃去上清后洗涤并重悬细胞，注入流式细胞仪进行检测，获取上述抗体T淋巴细胞占比。另外，通过病历资料，回顾包括年龄、性别、临床分期、病理类型、肿瘤直径在内的临床特征，并将患者的2年随访结局纳入统计分析。

2 结果

2.1临床特征比较 2组的年龄、性别、病理类型及肿瘤直径比较差异均无统计学意义(P>0.05)。高表达组的临床分期明显晚于低表达组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2免疫功能比较 高表达组外周血CD8+、CD4+ T淋巴细胞水平均明显低于低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组外周血IFN-γ水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3OS比较 高表达组的中位OS为9个月(95%CI为7.466，10.534)，低表达组的中位OS为14个月(95%CI为11.032，16.968)。高表达组的中位OS明显短于低表达组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.4相关性分析 外周血sPD-L1与CD8+、CD4+ T淋巴细胞以及OS水平均呈负相关性(P<0.05，P<0.01)，而与IFN-γ水平无相关性(P>0.05)。见表3。

3 讨论

人体免疫系统清除坏死细胞与肿瘤细胞有赖于T淋巴细胞的活化作用，肿瘤细胞表面可表达主要组织相容性复合体[8]，被T淋巴细胞特异性识别后可将其活化，协同共刺激分子与共抑制分子调控活化程度，维持整体免疫稳态，以防范正常情况下出现免疫活化不充分或活化过度，减少不必要的炎症损伤或引发自身免疫性疾病。

表1 2组胰腺癌患者的临床特征比较

表2 2组胰腺癌患者外周血CD8+、CD4+ T淋巴细胞以及IFN-γ水平比较

注：IFN-γ为干扰素-γ；与低表达组比较，aP<0.05

图1 2组胰腺癌患者的总生存期生存曲线

表3 外周血sPD-L1水平与免疫功能指标以及OS的相关性分析

注：sPD-L1为可溶性程序性死亡分子-配体1，IFN-γ为干扰素-γ，OS为总生存期

据相关文献报道，PD-1作为典型的共抑制分子，可固有表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞表面，而恶性肿瘤细胞及影响其浸润的免疫细胞则大量分泌PD-L1，二者结合后产生负性刺激信号，抑制免疫细胞活化，使其逃避免疫系统监视作用，肿瘤生长、侵袭与转移活性获得增强[9]。本研究结果显示，高表达组外周血CD8+、CD4+ T淋巴细胞水平均明显低于低表达组，且外周血sPD-L1水平与其呈明显负相关性。提示sPD-L1可通过与PD-1结合，促进T淋巴细胞凋亡、延缓细胞周期进展并减少其髓系来源，从而整体上大幅抑制T淋巴细胞增殖作用而使其衰竭。有研究报道，PD-1/PD-L1信号通路能有效减低T淋巴细胞运动性，增加其与中心/滤泡树突细胞间的作用时间[10]，共刺激分子控制失衡，增强调节性T淋巴细胞功能，效应T淋巴细胞活性随之下降。

IFN-γ为常见的炎性反应及肿瘤杀伤因子，其水平随细胞免疫功能提高而增高[11]，但在PD-1/PD-L1通路系统中，该物质也是PD-L1重要的诱导因子。有研究报道，PD-L1表达水平与IFN-γ存在显著剂量依赖性[12]。本研究结果发现，2组外周血IFN-γ水平比较差异无统计学意义，且与外周血sPD-L1水平无明显相关性，提示sPD-L1与IFN-γ之间具有相互但又相反的作用，IFN-γ可增强sPD-L1表达，但sPD-L1抑制免疫功能则减少IFN-γ合成，加之IFN-γ同样受到体内其他更多因素影响，因此不能单纯通过IFN-γ反映胰腺癌免疫应答能力。部分研究提出，通过药物阻断PD-1/PD-L1通路后，IFN-γ水平明显升高，猜测IFN-γ可能是肿瘤免疫激活与免疫抑制启动的关联物质，但该过程也可能被Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路所抑制，可成为肿瘤免疫治疗的新靶点[13]。

通常情况下年龄较大人群的免疫功能更差，因此可证实sPD-L1表达增高[14]，而针对胰腺癌而言，腺鳞癌与合并十二指肠腺癌的交搭跨越肿瘤恶性程度相对较高，理论上可通过PD-1/PD-L1途径更强效抑制免疫，但由于其发病率远不及导管腺癌，临床研究仍较少。本研究中，2组在年龄、性别、病理类型及肿瘤直径方面未见显著性差异，而高表达组临床分期明显较低表达组晚。提示胰腺癌进展程度更快的患者sPD-L1表达水平更高并向外周血释放，但其水平并未明显受患者年龄及肿瘤病理类型影响，究其原因可能与本研究纳入样本量较少有关，需在以后的研究中扩大样本量进一步探索其规律。

临床上针对不同分期的胰腺癌患者提出完全不同的治疗策略，随着PD-1/PD-L1单抗的研发与临床试验成功，能够一定程度上优化胰腺癌患者的预后，但由于尚未建立治疗适应证人群的筛选依据与评估标准，其次癌症病灶环境对单抗的敏感程度并非均匀，且规律又尚不十分明确，加之受到设备与技术限制，PD-1与PD-L1动态变化令其检测准确性与可重复性欠佳[15]，因而该疗法目前在国内推广应用仍有一定困难。本研究还发现，高表达组的中位OS明显短于低表达组，其与外周血sPD-L1水平呈明显负相关性，这提示不仅能在早期通过检测外周血sPD-L1评估预后，还证实可通过该指标结合临床分期情况，建立简单易行的PD-1/PD-L1单抗免疫治疗筛选机制，临床应用潜力较大。Kruger等[16]研究认为，sPD-L1可参与血液循环，与远处免疫细胞表面PD-1相结合发挥生理作用，因此其引起免疫抑制或逃逸作用并不局限于肿瘤的微环境内，而是全身广泛免疫功能障碍的表现，对其临床检测可初步了解肿瘤影响免疫范围。

综上所述，外周血sPD-L1水平可充分反映胰腺癌患者的免疫功能抑制情况，可通过早期检测为相关的临床诊治决策及预后评估工作提供可靠证据，有明确的临床指导意义。