甘草种子与种苗质量分级标准研究△

李文斌，尚兴朴，陈彩霞，罗琳，闫滨滨，邓庭伟，侯俊玲，4*，王文全，，4*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.中国中药有限公司，北京 100195；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；4.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 102488；

种子种苗是中药材生产的物质基础，优良品种及优质的种子种苗是实现中药材规范化生产的基础和首要条件[1]。目前，中药材种子种苗生产与流通存在质量标准缺乏或不完善、经营不规范的问题，与农作物、烟草种、草种等的品种选育和种子种苗标准化的进程相比还非常落后。而中药材质量的稳定需要中药材生产的规范化，中药材生产的规范化需要中药材种子种苗生产的标准化。随着中医药产业的发展，中药材种子种苗质量标准研究的重要程度日益显现。

甘草为豆科多年生植物，以根和根茎入药，为我国常用大宗药材。目前，栽培甘草已经成为甘草药材商品的主流，种植方式主要为种子直播与种苗移栽，而质量分级标准的缺乏与不完善也是导致甘草药材质量不稳定的重要原因[2-3]。因此，对全国主产区所流通的甘草种子、种苗开展质量分级标准的研究，以期为甘草药材的规范化生产提供科学依据与指导。

1 材料

1.1 种子材料

甘草种子于2016年9月分别搜集于内蒙古、甘肃、新疆等地，经中国医学科学院药用植物研究所王文全教授鉴定为甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的种子。种子产地来源信息见表1。

1.2 种苗材料

2017年4—6月，对我国甘草主要分布区的生产用种苗进行收集、调查，收集到8个批次的甘草种苗样品，共4994株，收集数据1600组。经中国医学科学院药用植物研究所王文全教授鉴定为甘草G.uralensisFisch.的种苗。种苗产地来源信息见表2。

表1 甘草种子的来源信息

注：A.中药材专业市场收集；B.地方商户收集；C.药材产地收集；D.从植株直接采集。

表2 甘草种苗的产地信息

2 方法

2.1 产量与质量指标的收集方法

甘草种子的发芽率、净度、千粒质量、含水量的测定方法参照GB/T 3543.1—3543.7《农作物种子检验规程》与于福来等[4]的研究结果。使用卷尺与游标卡尺分别测量种苗的根长与芦头直径(芦头下1 cm处直径)，钩秤测定百株质量。参考金燕清等[5]的测定方法测定甘草酸、甘草苷的相对含量。

2.2 种子、种苗质量分级方法

甘草种子质量分级方法采用K-均值聚类法对30份甘草种子的发芽率、净度2个质量指标数据进行K-均值聚类分析。含水量采用标准差法。

甘草种苗质量分级方法，根长和芦头直径采用标准差法，平均值加1倍的标准差作为一、二等的分界点，平均值作为二、三等的分界点，平均值减1倍标准差为三等的下限点。百株质量采用平均值法，各级种苗的百株质量平均值作为各级种苗的上限，对所调查种苗样本进行初步分级。所得数据用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2.3 田间试验布置

根据实验室分级结果，分别选择一、二、三级以及混合等级种子进行田间比较试验。试验地点设于北京中国医学科学院药用植物研究所试验田，砂质壤土。小区面积2 m2，3次重复。采用条播方式，行距15 cm，用种量约700粒/小区。小区间设置20 cm为保护行(隔离区)。2017年10月上旬对影响甘草药材产量的根系参数进行调查。每个小区取15株用于根参数调查，并对单株质量及单位面积的药材产量进行统计。

根据种苗初步分级结果，分别选择一、二、三级以及等外等级种苗进行田间比较试验。试验地点设在甘肃民勤农田地，砂质壤土。小区面积2 m2，3次重复。各等级种苗采用平栽方式，行距15 cm，每个小区100株。小区间设置20 cm为保护行(隔离区)。为了降低由于出苗率导致的株行距改变带来的影响，于2017年7月下旬利用储备的同一批材料进行补栽。2017年7月下旬对出苗率进行调查。分别于2017年10月上旬、2018年10月上旬进行取样，每小区取10株用于根参数调查，并对单株质量及单位面积的药材产量进行统计。

3 结果与分析

3.1 甘草种子质量分级

3.1.1种子质量分级指标的确定 发芽率、含水量、净度、千粒质量、纯度、生活力等指标常在甘草种子质量标准的制定中被使用(见表3)[6]。其中，发芽率是甘草发芽能力的重要指标，是种子内在质量的反映，为种子等级划分的决定性指标。净度是反映甘草商品性状的重要指标，在甘草种子的流通中，经常混有大量的杂质，给生产带来严重影响，因此适当提高净度标准有利于甘草种子商品质量的整体提高。甘草千粒质量受种质影响大，不同种质千粒质量差异显著[7]。含水量受气候影响大，主要影响种子贮藏。因此，选择发芽率、含水量作为甘草种子质量分级的主要指标，千粒质量和含水量作为重要的定性指标。

表3 甘草种子的部分质量标准

3.1.2种子质量分级 通过测定30份甘草种子的发芽率、净度、千粒质量和含水量(见表4)，并采用K-均值聚类法对30份甘草种子的发芽率、净度2个指标数据进行聚类分析，共分成3类，即3个等级(见表5)，方差分析表明，不同种子间发芽率、净度差异有统计学意义(P<0.05)。而不同野生甘草种群种子的千粒质量差异有统计学意义，含水量与种子贮藏有关，因此只作为这2项指标作为定性指标：千粒质量的平均值为(10.95±1.33) g，最小值为8.5 g，千粒质量一般为8～14 g，因此将8 g作为甘草种子的下限；含水量的平均值为(8.82±1.30)%，因此采用标准差法取其上限10.12%。依据以上结果形成草案，以此开展验证性实验。结合验证实验结果、甘草种子流通与生产实际，对种子质量分级标准草案进行调整。同时为解决不同等级的等距问题，以使标准更具操作性。将各指标尾数采用05或5-10且逢2.5进位取整法进行修约，并将等外级别舍掉，结果见表6。

表4 不同来源甘草种子发芽率、净度、千粒质量及含水量

表5 甘草种子分级指标K-均值聚类结果 %

表6 甘草种子分级标准

3.1.3不同等级种子间产量相关指标的比较 由表7可看出，3个等级间的根系参数有一定的不同，但差异无统计学意义，各等级单位面积保苗数与单位面积产量之间差异有统计学意义(P<0.05)，且一级>二级>三级。

单位面积产量(g)=单位面积保苗数(株)× 单株质量(g)

(1)

当各等级间的单根质量相似时，单位面积产量之间的差异来源于单位面积保苗数的差异。

单位面积保苗数(株)=[单位面积播种量(g)× 净度(%)×发芽率(%)×出苗率(%)]/ 千粒质量(g)

(2)

可见发芽率、净度与单位面积保苗数呈正相关。因此发芽率和净度不同的不同等级甘草种子，通过影响单位面积保苗数，最终影响单位面积产量。

3.2 甘草种苗质量分级

3.2.1种苗质量分级指标的确定 根长、芦头下1 cm处直径、芦头下20 cm处直径、单株质量为与药材产量相关的重要指标[8-9]，根长、芦头下1 cm直径、芦头下20 cm直径用于描述种苗和药材的形态，单株质量则直接与产量相关。但芦头下20 cm直径与单株质量的测量在实际生产中不易操作，在种苗采购中百株质量为1项重要指标，常用来计算1批种苗的平均单株质量。因此采用根长、芦头下1 cm直径、百株质量这3个指标用于甘草种苗的质量分级。

3.2.2种苗质量分级 测定1600株甘草种苗根长和芦头直径，结果显示：平均芦头直径为(0.59±0.24) cm，平均根长为(35.84±9.59) cm，可见，甘草种苗在不分级的情况下，不同个体在芦头直径和根长指标方面相差很大。按照2.2项下方法进行分级，甘草种苗各等级的实际频数分布显示(见表8)，一级苗为9.22%，二级苗为30.69%，三级苗为35.79%，等外苗为24.30%，合格率为75.70%，种苗各等级所占比例、合格率与种源、密度、田间管理有关，其中，内蒙种源种苗合格率高于较新疆种源种苗、一级种苗率。根长和芦头直径采用标准差

表7 不同等级种子间产量相关指标

注：处理间多重比较采用LSD法。同列字母表示P<0.05。下同。

表8 甘草种苗各样本的指标分布情况

法，百株质量采用平均值法，各级种苗的百株质量平均值作为各级种苗的上限，为了限定三级苗百株质量的下限，设置8批种苗中的三级苗的最小值0.20 kg作为三级苗的下限。依据种苗根长、芦头直径以及百株质量的测定结果进行初步分级，依据以上结果形成草案，以此开展验证性实验。结合验证实验结果甘草种苗流通和生产实际，对种苗等级初步聚类结果进行调整，结果见表9。

表9 甘草种苗质量分级标准

3.2.3不同等级种苗间产量相关指标的比较 由表10可知，不同等级的种苗的出苗率差异有统计学意义(F=199.42)，随着等级的下降，出苗率逐渐下降。不同等级的种苗在移栽1年后的药材在根长、芦头直径、单株质量3个指标方面差异有统计学意义：一级、二级、三级种苗的根长差异无统计学意义，但均与等外等级差异有统计学意义(F=10.64)；前三级与等外的芦头直径差异有统计学意义(F=43.53)；各级的单株质量差异有统计学意义(F=64.41)，且一级>二级>三级>等外。各级在单位面积的产量间差异有统计学意义(F=464.99)，二级和三级差异无统计学意义，原因是二级种苗的株数为41株，三级种苗为48株，属于取样带来的误差，但二级种苗单位面积产量的平均值要大于三级。

表10 移栽1年后不同等级种苗间产量相关指标

表11 移栽2年后不同等级种苗间产量相关指标

由表11可知，不同等级的种苗在移栽2年后的药材在根长、芦头直径、单株质量3个指标方面存在差异有统计学意义：一级、二级、三级种苗的根长差异无统计学意义，但均与等外等级差异有统计学意义(F=3.26，P<0.028 0)；前三级与等外的芦头直径差异有统计学意义(F=28.53)，且一级>二级>三级>等外；在单株质量方面，各等级差异有统计学意义(F=44.38)，一级与二级显著大于三级与等外。各等级在单位面积的产量间差异有统计学意义(F=30.82)，随着等级逐级下降。

3.2.4不同等级种苗间质量相关指标的比较 据表12结果显示：移栽1年后，不同等级的种苗在甘草酸、甘草苷含量方面差异有统计学意义：一级和二级种苗对应药材中的甘草酸含量显著(F=6.15，P<0.017 9)高于等外种苗对应的药材，前3级甘草酸含量差异无统计学意义，但均值依次下降。前3级甘草苷含量(F=16.54，P<0.000 9)高于等外；移栽2年后，不同等级在甘草酸、甘草苷含量方面差异有统计学意义：前3级种苗对应药材中的甘草酸含量显著(F=35.61)高于等外种苗对应的药材，一级和二级的甘草酸含量差异有统计学意义，与三级、等外相比均值依次下降；不同等级中甘草苷含量差异规律与甘草酸差异规律相似(F=69.44，P<0.000 1)。可见，不同等级种苗移栽1年和2年后，前3级种苗所对应的药材质量均优于等外等级。

表12 不同等级种苗间质量相关指标 %

3.2.5不同等级种苗的综合评价 利用主成分分析法分别对不同等级种苗移栽1年与移栽2年后药材的产量与质量进行综合评价。对不同等级种苗移栽1年药材的4个产量相关指标、2个质量相关指标以及出苗率指标进行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，将7个指标简化为2个因子，累计贡献率达97.67%，包含了7个指标的绝大部分信息。计算各等级种苗的主成分得分，依次为2.26、0.82、-0.54、-2.54，即在出苗率、产量、质量3个方面的综合评价中一级种苗最高，二级和三级种苗依次次之，且均高于等外种苗。

利用相同方法对不同等级种苗移栽2年后药材的4个产量相关指标、2个质量相关指标进行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，将6个指标简化为1个因子，累计贡献率达93.20%，包含了6个指标的绝大部分信息。计算各等级种苗的主成分得分，依次为2.66、0.94、-0.72、-2.88，即在产量、质量2个方面的综合评价中一级种苗最高，二级和三级种苗依次次之，且均高于等外种苗。

4 结论与讨论

甘草种子质量等级划分为3个等级，各级甘草种子的千粒质量不低于8 g，含水量不低于10%，一级种子：发芽率≥90%，净度≥90%；二级种子：90%>发芽率≥85%，90%>净度≥85%；三级种子：85%>发芽率≥80%，85%>净度≥80%，经验证，甘草种子质量等级划分合理，以上3个等级的种子规定为合格种子，在实际生产中定级时，任一指标不满足最低等级时，定为不合格种子，指标不能同时满足同一等级标准要求时，按照最低指标满足的等级进行定级，例如：千粒质量和含水量满足要求，发芽率为95%，净度为82%时，则定为三级种子。与孙群等[6]、张国荣等[10]的研究结果相比，只将发芽率与净度作为等级划分的指标，简化了检测步骤，更便于在生产实践中应用。甘草种子等级主要影响单位面积保苗数，后期的生长将受到株行距改变的影响，单株质量会产生一定的差异，但在规范的田间管理下，种植3年后的产量依然是受保苗数的影响较大。

甘草种苗质量等级划分为3个等级，一级种苗：根长≥45 cm，芦头直径≥0.8 cm，1.3 kg≤百株质量<0.8 kg；二级种苗：45 cm>根长≥35 cm，0.8 cm>芦头直径≥0.6 cm，0.8 kg≤百株质量<0.4 kg；三级种苗：35 cm>根长≥25 cm，0.6 cm>芦头直径≥0.4 cm，0.4 kg≤百株质量≤0.2 kg，经验证，甘草种苗质量等级划分合理，以上3个等级的种苗规定为合格种苗，在实际生产中定级时，种苗的根长和芦头直径作为分级操作的参照指标，而百株质量作为分级操作后检测复查的参照指标，当任一指标超出质量分级标准范围时，定为不合格种苗，指标不能同时满足同一等级标准要求时，按照最低指标满足的等级进行定级。同时，通过移栽后1年和移栽后2年的数据进行对比，发现其研究结果一致，说明已经分级的种苗在合理的采收年限内，不存在越级的情况。在田间对比试验中并未使用肥料，移栽2年后的药材，一级和二级的甘草酸和甘草苷含量均符合《中华人民共和国药典》标准，等外的甘草酸和甘草苷含量则未达《中华人民共和国药典》标准，三级虽未达标，但其含量均接近《中华人民共和国药典》标准。金燕清等[5]和张豆豆等[11]的研究结果显示，通过合理配施氮磷钾肥料可以有效提高甘草酸和甘草苷的含量与药材产量。可见，在规范的田间管理下合格种苗在移栽2年后均可以符合《中华人民共和国药典》标准。