不同青苔发病程度下柑橘叶片营养及叶际生物特征分析

杨 蕾，张云贵，杨海健，李勋兰，洪 林

(重庆市农业科学院 果树研究所，重庆401329)

青苔在柑橘树体上通常表现为叶面、果面、树干上出现的绿色斑块，是长江上游柑橘产区发生普遍的橘园生产问题。柑橘青苔不仅直接影响果实外观，而且严重阻碍柑橘树体的光合作用，破坏柑橘的生理代谢过程，进而影响果实品质，导致柑橘树势衰退[1-2]。青苔发生已给果农带来了巨大的损失，成为制约柑橘产业提质增效的主要影响因素之一。前期研究表明，柑橘青苔的主要病原为unculturedApatococcus等绿藻和病原真菌。柑橘青苔的发生主要受环境中温度、湿度及果园管理水平等多种因素控制，发生机制较为复杂。现阶段对柑橘青苔的防治多选择一些化学农药，如乙蒜素、代森铵、可杀得叁仟等[3-4]，此外套袋等农业措施也在一定程度上起到对柑橘果实表面青苔的防控作用[5]。目前对柑橘青苔的防治缺少环境友好型的方法，化学药剂防治效果差、成本高，且易对环境造成诸多负面影响，农业防治效果持续性差、局限性强。因此，开辟一条新的病害防治途径，对于避免病原物抗药性的增强和提高农产品质量安全具有重要意义。

矿质营养元素是植物正常生长发育所必需的，主要包括大量元素氮(N)、磷(P)、钾(K)，中量元素钙(Ca)、镁(Mg)、硫(S)和微量元素铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、硼(B)、钼(Mo)、氯(Cl)等。这些元素一方面可以作为植物组织的构成成分或直接参与新陈代谢而起作用，另外还可以改变植物的生长方式、形态和解剖学特性等，影响植物的抗病性[6]。矿质营养元素可以通过生物化学特性的改变，如产生大量的抑制性或抗性物质，增强或减弱植物对病虫害的抵抗力[7]，影响植物的生长和产量。因此，可以通过调节矿质营养这个重要的环境因子，改变寄主植物的形态结构和生理生化特征，从而达到增强寄主抗性、抑制病害发生的目的。病害的发生与植物营养有着密切的关系。N/Ca、K/Ca失调及缺钙会引起库尔勒香梨萼端黑斑病的发生并导致果实品质下降[8]。郑宏兵等[9]研究发现，当山核桃树皮中N、K、Mg的含量低而P、Fe的含量高时，山核桃易感病。适宜的B、Ca、Mo浓度降低蚕豆巧克力斑点病的发生率[10]。

矿质营养元素对柑橘各生理指标的变化有重要的作用，营养元素的丰缺显著影响柑橘产量和品质[11]。但目前矿质营养元素含量是否影响柑橘叶表青苔的发病程度未见报道，不同青苔发病程度下叶际生物群落结构的变化规律尚未明确，矿质营养元素-叶际生物-柑橘青苔发病程度间的相互关系缺少研究。本研究以晚熟柑橘品种W·默科特为试验材料，分析在柑橘青苔不同发病程度下叶片矿质营养元素含量和叶际生物群落结构的变化特征，旨在找到发病程度与矿质营养元素间的响应特征及关键元素的变化规律，探索性分析主要病原与矿质营养元素间的互作机制，为从养分水平调节控制柑橘青苔的发生提供理论依据，为柑橘青苔绿色防控提供新途径和参考。

1 材料与方法

1.1 样地设置

本实验采样地点为重庆市江津区白沙镇(简写为B)和李市镇(简写为L)。在两地各选1片栽植面积6.7 hm2左右、树龄为6 a、栽植密度为3 m×4 m、土壤类型为紫色土的W·默科特柑橘园为样地，调查其柑橘青苔病的发生情况。两地土壤养分基本情况如下：白沙镇样地有机质含量20.36 g·kg-1、全氮0.96 g·kg-1、碱解氮94.75 mg·kg-1、速效钾103.83 mg·kg-1、速效钙0.61 g·kg-1、速效镁0.09 g·kg-1、速效铜2.78 mg·kg-1、速效铁191.80 mg·kg-1、速效锰9.67 mg·kg-1、速效锌3.47 mg·kg-1、有效硼1.05 mg·kg-1；李市样地有机质含量13.25 g·kg-1、全氮0.84 g·kg-1、碱解氮75.96 mg·kg-1、速效钾181.47 mg·kg-1、速效钙1.92 g·kg-1、速效镁0.35 g·kg-1、速效铜1.47 mg·kg-1、速效铁122.00 mg·kg-1、速效锰52.95 mg·kg-1、速效锌3.47 mg·kg-1、有效硼1.08 mg·kg-1。

1.2 发病率及病情指数调查计算方法

2018年2月，在选好的样地中进行柑橘青苔病发生情况调查。在每个样地中划定3个调查区域，每个区域中柑橘青苔病的发生情况采用五点法进行调查取样，每一点选取5株树，每株树分为上下2层在东南西北4个方位各随机调查老熟叶片各25片，每株样树调查叶片200片，每个样地共调查15 000片柑橘叶片，分级记载所调查的叶片的数量，计算发病率及病情指数。

柑橘叶片青苔病分级方法如下(0级属于正常叶片)：

S=青苔面积/叶片总面积×100%

0级(G0)，S=0，健叶；1级(G1)，0

发病率(%)=(发病的叶片数/调查的叶片总数)×100。

病情指数=∑(病叶数×该病级代表数值)/(调查叶数×发病最高一级代表值)×100。

1.3 叶片矿质营养元素测定

叶样采集方法为：在1.2节中选定的每株样树上按东南西北4个方位上下2层随机剪取带叶枝条各3枝，每枝叶片数量>100片，将样枝带回实验室后收集全部老熟样叶。将所采集的两样地柑橘混合叶样按青苔病发病程度进行分组并编号，将不同组别叶样分别进行清洗、杀青和干燥预处理后，测定各病情等级下叶片中N、P、K、Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn、B这10种矿质营养元素含量[12]。将每组叶样分成3份测定矿质营养元素含量，每份叶片数>200片，每份叶样中每种元素含量测定时读取3个数值。采用硫酸-双氧水消解，半微量凯氏定氮法测定叶片N含量；采用钼锑抗比色法测定叶片全P含量；采用火焰光度计法测定叶片全K含量；采用硝酸-双氧水消解，ICP-aes/ms测定Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn、B含量。

1.4 叶表生物真核生物多样性测定

利用Illumina Miseq高通量测序技术探索各级叶片叶际真核生物的群落组成、丰度、差异及其与元素之间的关系，使用R语言工具制作相关图表，用SPSS软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同样地柑橘青苔病发病情况特征

通过调查发现，实验中选定的2个W·默科特果园青苔病的发生情况均较为严重，李市和白沙果园青苔发病率分别为84.60%和71.30%，病情指数分别为58.58和48.48(表1)。李市柑橘园青苔病的发病率和病情指数均高于白沙柑橘园。从具体病情指数特征来看，位于下层的柑橘叶片较上层而言发病程度更重；北面的柑橘叶片青苔发生最重，东面的柑橘叶片青苔病病情指数相对较低；两样地的柑橘青苔发病程度和病情特征较为一致。

2.2 不同发病程度下叶片营养特征

2.2.1 柑橘树体营养状况总体评估

本研究中两采样点之间柑橘叶片的N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、B这10种矿质营养元素含量均存在明显的差异(表2)，特别是李市点叶片中Cu元素含量几乎为白沙点叶片中2倍。李市点仅P、Mg和B三种元素含量要低于白沙点，其他7种元素含量均高于白沙点。以《柑橘营养诊断配方施肥技术规程》(DB50/T487—2012)为矿质营养水平评价标准[13]，李市点柑橘叶片10种元素中仅Fe含量处于偏高水平；N、P、Mn、Cu等4种元素含量处于适宜水平；Ca、Mg、B含量偏低；K、Zn 2种元素含量低，处于极缺水平状态。白沙点柑橘叶片中Fe含量稍偏高于适宜水平高值，N、P含量适宜；Ca、Mg、B含量偏低；而K、Mn、Zn、Cu 4种元素含量极缺。

2.2.2 柑橘青苔病不同病情等级下叶片矿质营养差异分析

分别对李市和白沙样地不同病情等级下叶片矿质营养元素含量进行方差分析，结果表明：处于不同病情等级下的不同样地中柑橘叶片中的10种矿质营养元素含量均存在极显著差异(P=0.000) (表3)。B含量变化幅度最大，其次为Fe、Cu含量，而N含量变化幅度最小。白沙3级叶片中B含量是白沙0级叶片中B含量的3.66倍，李市3级叶片中Fe含量是李市0级叶片中Fe含量的2.59倍，李市3级叶片中Cu含量是白沙3级叶片中Cu含量的2.54倍。

通过相关性检验和回归分析发现(表4)，除李市Mn和白沙Mg、Zn、B含量与病情等级间不存在相关性外，叶片病情等级与矿质营养元素含量间存在显著的相关性。2块样地中除N和Cu之外，其他叶片元素含量与病情等级的相关关系较为一致。其中Ca含量与病情等级存在极显著正相关关系，P含量与病情等级存在极显著负相关关系。此外，白沙叶片中的K含量、李市叶片的Ca含量与病情等级的正相关性很强，李市叶片的Mg含量与病情等级的负相关性很强。

2.3 不同发病程度下叶表生物多样性特征

2.3.1 柑橘青苔病叶叶表群落基本组成和结构

通过计算不同分类水平上鉴定出来的种系型，在所有样品中共鉴定到真核生物的163个门、159个纲、146个目、124个科、153个属和181个种(表5)。在属的水平上，除柑橘外占优势的属是Heterochlorella、Symmetrospora、Cladosporium、Sporidiobolus、Microsporomyces、Heveochlorella，它们在不同的病情等级上具有不同的相对丰度(图1)，分别对应的相对丰度为0.26%～15.13%、0.26%～10.48%、0.38%～8.93%、0.03%～13.29%、0.03%～3.92%、0.06%～2.29%。

表1 样地柑橘青苔病病情指数统计

Table 1 The disease index of citrus moss disease in different sample plots

样地Simpleplot发病率/%Incidencerate病情指数Disease index样点平均Average东上Eastupside南上Southupside西上Westupside北上Northupside东下Eastbottom南下Southbottom西下Westbottom北下Northbottom东East南South西West北North上Upside下Bottom白沙71.3048.4818.4032.8025.2834.4048.4872.6476.0079.8433.4452.7250.6457.1227.7269.24李市84.6058.3832.8076.4823.6862.2460.0063.5267.5282.4046.4070.0045.6072.3248.8068.36

表2 两样地柑橘叶片10种矿质营养元素含量

Table 2 The content of 10 kinds of mineral nutrient elements in citrus leaves in two sample plots

样地Sample plotN/(g·kg-1)P/(g·kg-1)K/(g·kg-1)Ca/(g·kg-1)Mg/(g·kg-1)Fe/(mg·kg-1)Mn/(mg·kg-1)Zn/(mg·kg-1)Cu/(mg·kg-1)B/(mg·kg-1)李市 L26.22±1.051.20±0.113.79±0.4927.34±3.042.23±0.26138.04±41.4925.54±1.9111.82±1.996.09±0.8328.61±5.31 b白沙 B24.97±1.131.44±0.183.59±0.3025.48±2.012.50±0.12121.22±20.7216.49±1.0910.12±0.943.43±0.6130.69±5.90 a

数据表示为均值±标准差。同一列数据后没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Data were expressed as the mean ± SE. The different lowercase letters within the same row indicate significant difference(P<0.05). The same as below.

表3 不同青苔病病情等级下叶片元素含量

Table 3 Mineral nutrient element contents in citrus leaves under different moss disease levels

样地Sampleplot病情等级DiseaselevelN/(g·kg-1)P/(g·kg-1)K/(g·kg-1)Ca/(g·kg-1)Mg/(g·kg-1)Fe/(mg·kg-1)Mn/(mg·kg-1)Zn/(mg·kg-1)Cu/(mg·kg-1)B/(mg·kg-1)李市L026.52±1.23 b1.37±0.23 c2.80±0.34 d23.16±2.15 f2.48±0.27 b85.21±7.62 e26.16±1.99 a11.02±0.96 cd4.48±0.51 c18.09±1.62 e127.37±1.73 a1.23±0.12 d3.76±0.47 b25.40±2.01 e2.57±0.19 a123.87±18.54 d25.60±2.03 a10.97±1.05 d5.60±0.64 bc28.46±2.45 c226.73±1.06 b1.30±0.12 cd4.03±0.58 a26.72±2.86 c2.38±0.20 c125.06±19.02 d24.81±2.14 a10.27±1.32 e6.52±0.82 b28.51±2.51 c326.94±0.87 a1.08±0.18 e4.41±0.25 a26.80±2.56 c2.07±0.17 e220.67±21.47 a25.67±1.58 a11.53±1.47 b7.01±0.61 a29.98±3.07 c425.53±1.59 c1.10±0.09 e3.83±0.36 b29.09±3.14 ab1.97±0.12 e123.70±19.36 c22.27±1.78 b10.93±0.83 d6.57±0.58 b30.87±3.15 c524.23±1.47 d1.10±0.11 e3.93±0.48 ab32.87±3.89 a1.89±0.19 e149.70±18.20 b28.74±2.22 a16.18±1.25 a6.36±0.81 b35.78±3.32 b白沙B023.23±1.02 d1.72±0.14 a3.30±0.29 cd21.71±1.78 f2.38±0.25 c101.46±18.45 cd14.92±0.69 d11.35±1.00 bc4.18±0.55 c17.81±1.25 e124.79±2.01 d1.65±0.13 a3.25±0.34 d24.47±2.32 e2.59±0.23 a110.09±21.32 c16.12±0.87 d9.60±1.09 ef4.34±0.47 c22.73±2.02 d224.93±1.23 c1.45±0.08 b3.46±0.41 c25.60±2.15 e2.59±0.28 a104.30±23.24 cd15.38±0.83 d9.08±0.65 f3.18±0.50 d21.14±1.88 d327.00±1.08 a1.35±0.14 c3.70±0.25 b26.96±2.20 c2.56±0.18 a122.21±20.57 c17.52±1.25 c8.96±0.71 f2.76±0.41 e65.15±5.47 a424.45±1.78 d1.27±0.10 cd3.68±0.68 b27.98±3.26 b2.56±0.21 a163.04±26.15 a17.14±1.04 cd10.81±0.86 d2.86±0.36 e28.60±2.09 c525.43±1.06 c1.23±0.11 d4.13±0.31 a26.15±2.78 d2.30±0.24 c126.23±15.02 c17.84±1.58 c10.93±0.98 d3.23±0.33 d28.73±2.56 c

表4 不同样地叶片矿质营养元素含量与病情等级相关性

Table 4 The correlation between mineral nutrient elements contents and the disease level

元素Nutrient element样地Sample plot斜率SlopeR2方程EquationFtP值P-valueNL-0.47890.6056y=-0.4798x+27.924.558-4.9560.000B0.34270.2687y=0.3427x+23.7715.93743.1910.027PL-0.05650.7490y=-0.0565x+1.395745.607-6.7530.000B-0.10480.9564y=-0.1048x+1.8102344.49382.0020.000KL0.17930.3896y=0.1793x+3.166610.0243.1660.006B0.16280.8767y=0.1628x+3.016109.34210.4570.000CaL1.70570.9163y=1.7057x+21.37175.57742.6270.000B0.97440.6886y=0.9744x+22.06835.2535.9370.000MgL-0.1450.8958y=-0.145x+2.7334134.326-11.5900.000B-0.01580.0547y=-0.0158x+2.55270.837-.09150.374FeL11.930.2411y=11.93x+96.2825.0842.2550.039B8.58990.5013y=8.5899x+91.15516.0784.0100.001MnL0.1080.0093y=0.108x+25.1630.1500.3870.704B0.56620.7860y=0.5662x+14.50758.2197.6300.000ZnL1.10840.5359y=1.1084x+8.650312.4893.5340.003B0.04310.0570y=0.4381x+8.5650.0860.2920.774GuL0.36590.5626y=0.3659x+4.810320.5064.5280.000B-0.27280.5813y=-0.2728x+4.381222.280-4.7200.000BL2.77630.7974y=2.7763x+18.89762.9577.9350.000B3.31990.1272y=3.3199x+19.0732.3331.5270.146

表5 不同分类水平下的物种注释表

Table 5 The classified phylotypes detected at different taxonomical levels

分类TaxonB0B1B2B3B4B5L0L1L2L3L4L5界Superkingdom162181117165148148108152110180153180门Phylum14716310214712913799135101149130159纲Class1421561011381291319513695153132159目Order131146901321181159012585142124146科Family1051227811497987010267121104124属Genus135151951371231259513193150131153种Species162181117165148148108152110180153180

图1 属水平下优势物种丰度Fig.1 The relative abundance of dominant species at genus level

2.3.2 柑橘青苔病不同病情等级下真核生物群落组成与多样性差异

在属水平上(图2)，病情等级1下优势属是Heterochlorella、Sporidiobolus和Cladosporium，病情等级2下优势属是Heterochlorella、Symmetrospora和Microsporomyces，病情等级3下优势属是Heterochlorella、Cladosporium和Sporidiobolus，病情等级4下优势属是Heterochlorella、Cladosporium和Heveochlorella，病情等级5下优势属是Heterochlorella、Cladosporium和Microsporomyces。随着病情等级提高，Microsporomyces、Heterochlorella和Cladosporium的相对丰度与病情等级呈正相关关系。

在种水平上，属于Trebouxiophyceae(共球藻纲)的unculturedApatococcus、Heterochlorellaluteoviridis和Heveochlorellahainangensis的丰度与病情指数等级呈极显著的正相关关系(表6)，而前期研究表明，这3种藻类是引发柑橘青苔的主要病原物，即病情等级会随着主要病原物的相对丰度的增加而升高。

对2个样地中处于6个病情等级的12份样品的叶表真核生物的α多样性指标进行检测计算，结果见表7，方差分析表明12个样品的α多样性指标存在显著差异(P<0.05)。12组数据α多样性指标均在病情等级为2级时最低，在病情等级为1级或是3级时最高；随着病情等级的提高，α多样性呈现先升后降再升再降的趋势。

图2 样品在属水平上的相对丰度Fig.2 The relative abundance of different samples at genus level

表6 不同病情等级下3种藻类的相对丰度变化

Table 6 Relative abundances of species unculturedApatococcus，Heterochlorellaluteoviridis，Heveochlorellahainangensisfrom samples with different disease levels

样品编号SampleunculturedApatococcus/%Heterochlorellaluteoviridis/%Heveochlorellahainangensis/%B02.931.810.14B13.603.510.48B29.313.380.33B315.784.530.23B418.619.601.21B542.9619.331.71L00.400.260.06L117.833.640.32L221.513.280.48L328.404.500.54L430.594.551.16L538.6715.132.29

2.4 柑橘青苔主要病原物与叶片矿质营养元素间的关系

2.4.1 物种与矿质营养元素相关性分析

基于Pearson相关性分析各物种与矿质营养元素间的相关性，以相关系数|cor|>0.3且P<0.05作为显著性筛选阈值，筛选与各元素显著相关的物种。本研究重点关注了几种柑橘青苔病原物与矿质营养元素间的相关性。结果显示(表8)，最主要的病原物unculturedApatococcus与P呈极显著负相关，与K、Ca呈极显著正相关，与Mg呈显著负相关；Heveochlorellahainangensis与Fe呈极显著正相关，与K呈显著正相关；可能的病原物Occultifurexternus、Coniochaetalessp. GMG C4分别与Fe、B呈极显著正相关。

2.4.2 矿质营养元素对叶表真核生物物种组成的影响

冗余分析(redundancy analysis，RDA)是基于线性模型的约束性排序分析，可以解释环境因子对于样本中物种组成的影响。根据红色箭头射线的长短可以看出，对柑橘叶表真核生物类群影响作用由大到小依次为P>Fe>Mn>Cu>Mg>N>K>Zn>Ca>B(图3)。菌群-虚线中心连线与箭头之间的夹角代表了样本/菌群与环境因子之间的相关关系(夹角为锐角时表示呈正相关关系，钝角时呈负相关关系，直角表示不相关)，结果显示，主要病原菌unculturedApatococcus、Cladosporiumherbarum与P、Mg呈负相关，与Fe、Mn、Cu、N、K、Zn、Ca、B呈正相关。

表7 α多样性指数统计表

Table 7 The statistical table of α diversity index

样品编号SamplesObservedChao1ACEShannonInvSimpsonCoverageB0162 d187.50 f192.15 e1.27 i0.45 g0.999664B1181 a216.00 b213.84 a2.21 a0.76 b0.999644B2117 h127.50 l135.26 k0.83 k0.32 i0.999792B3165 c190.20 e199.47 d1.48 g0.57 e0.999644B4148 g190.27 d173.40 f1.49 f0.56 f0.999693B5148 g160.50 i169.58 g1.77 e0.71 d0.999743L0108 j153.09 j151.64 j0.49 l0.18 j0.999683L1152 f161.50 h165.74 i1.96 d0.78 a0.999802L2110 i133.10 k130.74 l1.07 j0.45 h0.999782L3180 b226.75 a212.29 b2.09 b0.73 c0.999664L4153 e169.50 g169.06 h1.43 h0.59 d0.999782L5180 b211.06 c207.03 c2.04 c0.76 b0.999674

表8 柑橘青苔主要病原物与矿质营养元素相关性

Table 8 The correlation between mineral nutrient element contents and the main pathogen

物种Taxon矿质营养元素Nutrientelement相关系数CorP值P-valueUncultured ApatococcusP-0.770820.0033Uncultured ApatococcusK0.7575180.0043Heveochlorella hainangensisK0.6894830.0131Uncultured ApatococcusCa0.7164350.0088Uncultured ApatococcusMg-0.593040.0421Heveochlorella hainangensisFe0.9273970.0000Occultifur externusFe0.8452090.0005Coniochaetales sp. GMG_C4B0.8996540.0001

图3 多样本矿质营养元素与样本/物种 RDA 分析Fig.3 RDA analysis of nutrient element and sample/species

综合分析柑橘叶片矿质营养元素含量、叶表真核生物群落结构与柑橘青苔病病情等级的关系可以发现，两组关系存在一致性：叶片中P、Mg含量与病情等级、主要病原物相对丰度呈现负相关关系；叶片中Ca、K含量与病情等级、主要病原物相对丰度呈现正相关关系。

3 讨论

矿质营养元素既可以作为植物体的组成成分，又可以参与或调节细胞中重要的代谢过程。其不仅调控植物的正常生长发育，而且改变微生物群落结构[14]，影响病原菌和微生物生长，以多种方式直接或间接地影响植物的感病和抗病性，在病害控制中扮演重要角色。青苔是三峡库区柑橘果园的重要病害，在低洼、郁闭老果园发病较重。柑橘健康叶表有许多异形细胞或油胞破裂而形成的凹陷小坑，附生菌主要分布在叶片的上表皮细胞内和栅栏组织中，亦可寄生在细胞内或细胞间隙。而寄生藻类生长所需矿质营养元素的来源取决于柑橘叶片中破裂的油胞、角质膜等特殊结构[15]。本研究结果显示，不同柑橘青苔病发病程度下的叶片矿质营养元素含量和叶际生物群落结构差异显著。P和青苔发生之间的关系最显著，Ca和K含量与青苔的发生关系密切，Fe、Mg与青苔的发病程度有一定的相关性但贡献率较P和Ca小。

本研究中，unculturedApatococcus、Heterochlorellaluteoviridis和Heveochlorellahainangensis三种主要病原物丰度与发病程度极显著正相关，P、Ca与unculturedApatococcus丰度均呈极显著负正相关关系，其他如K、Fe、Mg等元素与主要病原物丰度之间仅表现出一定的相关关系，说明P和Ca可能是青苔滋生并侵染柑橘叶片过程中最为重要的影响因子。目前人们普遍认为P有利于植物生长发育，但也有少量研究表明P会增强病原物对植物的侵染[16-17]。P是藻类生长最主要的矿质营养元素之一，是藻细胞核酸和膜的主要成分，也是三磷酸腺苷(ATP)的主要元素。在营养液培养环境条件下，添加N和P可促进绿藻相对丰度显著增加[18]，且中、高P水平条件下藻类生物量要明显高于低P水平[19]，高P水平的环境条件下藻类生长速率更快，单位叶绿素光合效率更高，低N/P更有利于藻细胞的生长[20]。近年来，我们也发现柑橘栽培过程中过多使用KH2PO4等含P叶面肥会加重青苔的发病程度，进一步表明青苔病原藻类的生长繁殖与P关系密切，柑橘叶片可能为青苔病原藻类的生长繁殖提供场所和P源。随着青苔病情等级提高，主要病原unculturedApatococcus丰度明显增加，而叶片P含量下降，两者之间呈极显著负相关，分析其原因可能是unculturedApatococcus生长繁殖需要从叶片中吸收P元素作为主要营养来源。Ca在植物体内可参与调控防御反应，提高寄主植物对外部病原微生物的抵抗能力[21-22]。在黄龙病侵染纽荷尔脐橙的研究中发现，黄龙病侵染后植株叶片中Mg、Mn、Fe和Zn等与叶绿素合成及光合系统相关的矿质营养元素显著减少，而叶片Ca含量随着黄龙病侵染时间的延长而增加[23]。而在本研究中，我们发现随着病情等级的增加，青苔主要病原物的相对丰度不断升高，叶片Ca含量也逐渐增加，并显著高于未发病叶片中Ca的含量，与黄龙病侵染脐橙的研究结果一致。相关性分析表明，主要病原物unculturedApatococcus的相对丰度与Ca含量呈极显著正相关，说明Ca含量的上升可能是植物细胞增强其对病原物侵染耐受性的一种方式，推测青苔滋生可能刺激叶片Ca元素的吸收、转运和积累，激发了植物体Ca2+信号调控的病害防御反应途径，或与钙调蛋白(CaM)相结合后可直接调节植物抗病相关基因的表达[24]。有研究表明，植物细胞质中游离Ca2+浓度过高时可与磷酸盐形成沉淀，干扰与P代谢相关的信号转导，进而影响植株的正常生长[25]；反之，P逐渐累积，Ca有效性降低，同时影响Fe、Zn等微量元素积累，造成植株养分吸收极不均衡[26]。本研究发现，伴随青苔病病情等级增加，柑橘叶片中Ca含量和P含量恰好呈相反的变化趋势，但这是否表明P的减少是由藻类生长消耗所致或是Ca的拮抗作用仍不清楚，需进一步深入探讨。K被广泛认为可通过改变寄主植物的化学和物理结构来增强病原物和害虫的抵抗力[27]。试验发现unculturedApatococcus和Heveochlorellahainangensis两种藻类丰度分别与叶片K含量呈极显著和显著正相关，推测这两种藻类侵染可能作为环境胁迫因子激活叶片免疫防御反应，植物体通过在叶片中积累更多的K，来获得更高的抗病能力。Fe在植物细胞氧化还原系统和多种酶中扮演重要角色，最近的研究认为Fe也是影响藻类生长的主要限制因素[28]，低光照强度下藻细胞的生长率较低，但是藻细胞却需要吸收更多的P和Fe[29]。本试验中，不同发病等级的叶片Fe含量要显著高于健康叶片，Heveochlorellahainangensis和Occultifurexternus两种病原物的丰度与Fe呈极显著正相关，说明Fe和病原物的生长关系密切，且Fe对上述两种病原的生长可能起到一定的促进作用。Mg在植物中作为其他物质的亲和配体，是叶绿素和蛋白合成的重要元素，在很多酶发挥功能中起重要作用。Mg、S等元素削弱植物的抗病性，而提高了植物的发病率，比如增施镁肥反而促进了立枯病对豇豆幼苗的侵染[30]。而本研究中，unculturedApatococcus与Mg呈显著负相关，即unculturedApatococcus丰度增加时，叶片中Mg含量降低，并且病情等级越高，含量越低，其原因有待进一步研究。有研究认为，植物体内Ca和K两种元素的吸收之间存在拮抗作用[31]，Mg与Ca间也有类似效应[32]，此外Mg也会影响作物对N、P、K的吸收和利用率[33]。试验发现不同发病等级下李市采样点叶片中Ca含量增加，Mg含量降低，与上述拮抗效应的表现相符。另外，光合作用是藻类生长繁殖的关键生理代谢过程，Mg又是作为叶绿素的重要组成元素。因此，Mg含量与病原物丰度之间的消长关系也有可能是青苔病原物快速生长的过程中吸收叶片中的Mg所引起的。

叶片作为植物光合作用的主要场所，为叶际生物的定殖提供了良好的生活环境。近年来，高通量测序技术不断发展，大大促进了植物叶际微生物组成和结构方面的深入研究。微生物中致病菌不仅影响植物健康，也影响植物相关微生物的组成和结构[34]。本研究发现，主要病原物的丰度随着病情等级的升高而增加；而柑橘叶表真核生物α多样性随着病情等级的提高呈现先升后降再升再降的趋势，即α 多样性指标在病情等级为2级时最低，在病情等级为1级或是3级时最高。本研究结果显示，叶片十分健康或严重发病的情况下，叶际生物多样性均较低。这种规律与对山核桃干腐病[35]、黄瓜枯萎病[36]等的研究结果基本相同，而与Rosenzweig等[37]发现健康叶片上的微生物多样性大于发病植株这一结论不完全一致。产生本试验结果的原因可以推测为：单个病原物或有益微生物的丰度变化都可能导致整个微生物组成的改变，且在发病程度不断加重的过程中叶际生物群落结构因各物种之间复杂的相互作用而使得平衡关系不断调整，呈现出交替变化的趋势。在健康植株中可能存在优势拮抗生物种群，其代谢产物可以抑制或是杀死其它病原菌群[38]，使得生物多样性较低；当有少量病原物入侵后，增加了新的物种，多样性指标随之增高；而当病原物丰度较高，成为优势种群后，可能会通过产生毒素等有害物质抑制其他种群数量[39]，多样性由此而降低。

根据此研究结果可以明确柑橘树体中矿质营养元素与青苔病的发生间存在联系，但矿质营养元素与病原物的群落特征间存在着复杂的相互作用，目前尚缺乏有效的方法来分析、解释、验证它们之间的关系，故需要进一步研究各矿质营养元素与病害间的关系，特别是其对树体微生态、病原物侵染、发育的影响机理，探索一条基于矿质营养水平调控的柑橘青苔病绿色防控新路径。