Xpert MTB/RIF联合SAT技术快速检测痰标本中利福平耐药结核菌 ?

马娟 陈俊林 黄飞 徐费凡 瞿梅 顾德林

【摘要】 目的：探讨Xpert MTB/RIF联合SAT技术（RNA恒温扩增实时检测法，MTB-RNA）快速检测痰标本中耐药结核分枝杆菌（MTB）价值。方法：对2015年2月-2017年10月在南通市第六医人民院就诊172例复治肺结核患者涂阳痰标本分别进行Xpert MTB/RIF检测、SAT检测、BACTEC MGIT960培养及利福平（RFP）药敏试验。对MTB-RNA检测阳性同时Xpert MTB/RIF报告RFP耐药的痰标本予RFP药物灭菌72 h后再进行SAT检查，将Xpert MTB/RIF联合SAT检测的结果与BACTEC MGIT960药敏结果进行对照分析。结果：Xpert MTB/RIF检出耐RFP痰标本56例，BACTEC MGIT960鉴定为MTB且耐RFP痰标本44例。SAT检测报告MTB-RNA阳性同时Xpert MTB/RIF检出耐RFP标本50例，其中经过RFP作用72 h后再进行SAT检测报告MTB-RNA阳性标本仅46例，稍高于BACTEC MGIT960药敏结果，但差异无统计学意义（字2=0.25，P>0.05）。结论：利用Xpert MTB/RIF联合SAT技术能快速检测痰标本中耐药MTB，对及时精准制定抗结核治疗方案具有重要参考价值。

【关键词】 结核分枝杆菌 利福平 药敏试验 XpertMTB/RIF RNA恒温扩增实时检测法

[Abstract] Objective： To assess the value of rapid detecting heterogeneity drug resistance mycobacterium tuberculosis （MTB） in sputum specimens by Xpert MTB/RIF joint SAT tests （RNA real-time thermostatic expansion SAT tests，MTB-RNA）. Method： A total of 172 cases sputum smear-positive specimen of recurrent pulmonary tuberculosis patients from February 2015 to October 2017 in Nantong Sixth Peoples Hospital were detected by Xpert MTB/RIF methods， SAT， BACTEC MGIT960 cultivation and rifampicin （RFP） drug sensitive test respectively. The sputum specimens of MTB-RNA positive and RFP resistant which rely on the Xpert MTB/RIF identification at the same time were detected by SAT again After 72 hours of RFP drugs sterilization， the testing results of Xpert MTB/RIF joint SAT were comparison analyzed with BACTEC MGIT960 susceptibility results. Result： A total of 56 cases sputum specimen of RFP resistant were detected by Xpert MTB/RIF， 44 cases RFP resistant MTB in sputum specimens were identified by BACTEC MGIT960. A total of 50 cases sputum specimen of MTB-RNA positive and RFP resistant at the same time were detected by SAT and Xpert MTB/RIF， among only 46 cases sputum specimen of MTB-RNA positive were detected by SAT after 72 hours of RFP action， the results slightly higher than BACTEC MGIT960 susceptibility， there were no statistically significant differences （字2=0.25， P>0.05）. Conclusion： The heterogeneity drug resistance MTB can be quickly detected by MTB/RIF joint SAT technology. It has important reference value for timely and accurate develop anti-tuberculosis treatment scheme.

利福平（RFP）是目前最重要的一線抗结核药物，但近年来耐RFP结核病有逐年上升趋势，国内外对耐RFP结核病非常重视，并将其列入耐多药结核病诊治范畴（简称RR-TB）[1-2]。如果能早期诊断耐RFP结核病并即时调整治疗方案，可能会避免低频率、低耐药MTB逐步演变成高耐药、耐多药甚至全部耐药MTB，从而提高治愈率，降低治疗成本和减轻患者身心痛苦。相对于检测耗时过长的罗氏培养及比例法药敏技术和价格昂贵、推广受到限制的自动化表型药敏检测技术BACTEC MGIT960[3]，目前已推广并广泛应用至国内地市级以下医院的Xpert MTB/RIF检测技术，仅需要几小时就能自动筛查出标本中是否存在MTB及RFP耐药情况，即使存在比例较低异质性耐RFP的MTB也能被有效检测到，已成为早期快速诊断耐RFP结核病最有效的自动化分子药敏检测技术[4-5]。但在检测临床标本过程中发现Xpert MTB/RIF和表型药敏检测结果方面存在一定差异[6]，可能会对制订抗结核方案带来困惑。笔者尝试利用Xpert MTB/RIF联合SAT技术（RNA恒温扩增实时检测法）来快速检测痰标本中耐药MTB，来弥补Xpert MTB/RIF检测不足，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 菌株来源 MTB标准株（H37Rv ATCC27294）购自国家菌种保藏中心，172例涂阳痰标本来自2015年2月-2017年10月在南通市第六人民医院就诊的复治肺结核患者。其中男110例，女62例，年龄22～82岁，平均（49.5±2.0）岁。对每例复治肺结核患者均详细记录用药史、症状及胸部影像学检查情况。

1.1.2 主要试剂和仪器 iddlebrook 7H9培养基干粉、OADC营养添加剂、Bactec MGIT检测仪、Bactec MGIT试剂[购自美国BD（Becton Dickinson）公司];RFP购自美国Fluka公司;GNP-92700隔水式培养箱购自上海精宏实验设备有限公司;Gene Xpert仪器及Xpert MTB/RIF检测试剂盒购自美国Cepheid公司;MTB核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增，商品名TB-SAT）、分枝杆菌超声破碎仪购自上海仁度生物科技有限公司;ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色涂片 检测操作按照文献[7]《结核病诊断实验室检验规程》中的标准化操作程序进行操作。痰抗酸杆菌菌量按萎-尼染色镜检结果菌量分级标准以1+、2+、3+、4+记录，其中20例标本1+，37例标本2+，63例标本3+，52例标本4+。

1.2.2 标本处理 取干酪样或脓样晨痰1 ml于试管内，加入4%NaOH 4 ml并进行振荡使痰液充分消化，移入37 ℃水浴箱，15 min后用1 mmol/L的磷酸盐缓冲液中和，3 000 r/min离心，30 min后移入37 ℃水浴电热恒箱内。

1.2.3 BACTEC MGIT960 按照BACTEC MGIT960操作说明，进行分枝杆菌液体培养、菌型鉴定及RFP药敏试验（培养基的RFP药物终浓度为1.0 μg/ml），仪器在一定时间内自动报告敏感与耐药结果。质量控制：每次药敏试验均采用H37Rv标准株作为阳性参照。

1.2.4 Xpert MTB/RIF核酸扩增检测 按试剂说明书将之前处理后标本加入检测反应盒，上机进行检测，系统自动进行检测和结果判断，2 h内判断标本内是否存在MTB及是否对RFP耐药，反应结束后在检测系统窗口下直接观察测试结果。结果报告为：MTB检出或未检出，检出菌量报告结果为高、中、低、极低;MTB检出报告同步显示RFP耐药的结果：△CT≥3.5，RFP耐药;△CT<3.5，RFP敏感（CT是指探针循环域值，△CT指探针早期CT值与晚期CT值之差），耐药检测探针分别为：probe A、probe B、probe C、probe D、probe E。

1.2.5 TB-SAT检测 根据试剂盒说明书进行操作，将液化好的结核标本进行稀释，再用超声波处理仪进行超声处理15 min。超声结束后，取2 μl处理标本加入30 μl扩增检测液中，开启恒温荧光检测仪器进行检测。

1.2.6 其他 痰标本RFP处理后再进行TB-SAT检测，流程参照文献[8]进行：取0.5 ml痰处理标本分别接种至对照管（不含药物）及加药管（RFP终浓度为1 μg/ml）的7H9液体培养基中，培养管总体积为1 ml，37 ℃培养72 h，进行SAT检测。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计学处理，计数资料采用率（%）表示，两组间比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 172例涂阳痰标本检测结果

BACTEC MGIT960培养报告阴性标本18例，阳性标本154例;4例鉴定为非结核分枝杆菌，150例鉴定为MTB，药敏结果显示耐RFP 44例。Xpert MTB/RIF检测到167例，检出菌量报告结果为高87例，中38例，低34例，极低8例;检出耐RFP 56例，菌量报告结果为高20例，中16例，低14例，极低6例;probe D及probe E检测结果共40例，占71.4%。SAT检测报告MTB-RNA阳性154例。56例耐RFP标本中菌量与探针结果关系见表1。

2.2 Xpert MTB/RIF、Xpert MTB/RIF+SAT与BACTEC MGIT960在检测RFP耐药结果的差异比较

单独利用Xpert MTB/RIF检测到耐RFP标本56例，与BACTEC MGIT960诊断RFP耐药有差异性标本13例，多见于耐药基因突变，多为探针A、B、C探查结果或者含二线方案治疗中>3个月的患者痰标本，见表2;Xpert MTB/RIF检测到耐RFP标本56例中同时SAT检测报告MTB-RNA阳性有50例，将这50例MTB-RNA阳性标本经过RFP作用72 h后再进行SAT检测，报告MTB-RNA阳性标本46例，与BACTEC MGIT960同时诊断RFP耐药为43例，有差异性标本4例，差异无统计学意义（字2=0.25，P>0.05），见表3。

3 讨论

耐RFP结核病有赖于早期诊断和有效治疗，但耐RFP结核病形成是一个缓慢的过程，即低耐药MTB从零星出现逐步演变成高暴露、高耐药MTB过程，对这个过程中不同时间的痰标本进行检测可能出现分子药敏和表型药敏不一致性[9]，因此如果能早期检测出复治肺结核患者痰标本MTB中低频率的RFP异质性耐药菌，可能成为提高其治愈率、减轻致残率的关键。常规MTB药敏试验方法，如罗氏培养及药敏试验耗时过长不能满足临床需要，自动化BACTEC MGIT960表型药敏检测方法因价格问题无法推广应用。而近年来临床广泛应用检测MTB及RFP耐药的Xpert MTB/RIF分子药敏技术采用半巢式PCR，针对rpo B基因81 bp RFP）耐药决定区设计了5個分子信标探针（以probe A、probe B、probe C、probe D、probe E命名），以检测标本中是否存在MTB及是否对RFP耐药，是将MTB的DNA提取、PCR扩增和荧光检测结合在一起，并自动报告结果的检测系统，国内外应用Xpert MTB/RIF检测MTB及其RFP耐药报道较多[10-12]。

笔者在临床应用过程中发现利用Xpert MTB/RIF诊断RFP耐药虽然快速，仅需要3 h就能得到结果，但利用Xpert MTB/RIF检测的结果与BACTEC MGIT960仍然有一定差异。进一步对检测耐RFP的MTB分子信标探针结果进行对比发现，probe D及probe E探针结果共40例，占71.4%，probe A、probe B及probe C探针结果共15例，而probe A、probe B探针检测到基因突变片段可能为低耐药或无意义突变[13];同时在实际检测过程中发现患者送检痰标本的时间节点不尽相同，即部分患者留取痰标本前可能进行了有效用药，长时间、广覆盖的治疗可能会造成涂阳痰标本中MTB状态多样性，如活菌、DNA未降解的死菌，L型MTB等;而Xpert MTB/RIF是基于MTB的DNA提取、PCR扩增为基础的，意味着对患者痰标本中各种状态的MTB都能进行有效检测，不能区别死菌和活菌;同时Xpert MTB/RIF检测标本中异质性耐药结核菌存在一定阈值限制，本实验组通过临床实验发现，如标本中RFP耐药MTB低于15%的比例，Xpert MTB/RIF检测rpo B基因突变的能力明显减低。因此Xpert MTB/RIF能快速检测到标本中MTB存在rpo B基因突变，单独依靠Xpert MTB/RIF检测结果来制定治疗方案存在一定的风险。

笔者就如何快速解决这一问题进行了认真探索，发现利用SAT-TB检测技术检测痰标本中MTB-RNA能有效弥补Xpert MTB/RIF不足。现正在推广使用检测MTB-RNA的新技术SAT-TB[14-15]，是以MTB特异的16srRNA为检测靶标，通过恒温扩增技术扩增RNA靶标片段，对荧光标记的探针与靶标片段的扩增产物杂交后释放出荧光信号进行实时检测，从痰标本处理到最终报告结果仅需几小时，能快速准确地诊断检测样本中是否存在MTB，且SAT-TB只能检测活的MTB，因为MTB死亡后RNA能快速降解[16]，不同于双链结构的DNA有1～2个月才降解的超长平台期。从本组利用SAT-TB检测数据看，Xpert MTB/RIF检测到耐RFP标本56例中同时SAT检测报告MTB-RNA阳性有50例，表明有6例标本中MTB基本为死菌。将50例标本使用RFP杀菌72 h，即将标本中敏感MTB杀灭后再利用SAT检测，结果有46例痰标本MTB-RNA为阳性，提示这46例标本中存在RFP耐药MTB且为活菌，接近于BACTEC MGIT960药敏结果（字2=0.25，P>0.05）。利用基于DNA的Xpert MTB/RIF联合基于RNA的SAT-TB分子药敏技术方案来快速检测痰标本中RFP耐药MTB，可以较准确判断标本中MTB对RFP耐药程度、耐药菌是否为活菌，类似于分子药敏结合表型药敏技术，对快速制定抗结核治疗方案和综合评估治疗效果有非常大的帮助，能基本满足临床的需要。

本检测方案不足之处在于Xpert MTB/RIF仅能涵盖rpoB基因81 bp RFP耐药决定区，对可能存在耐药决定区外少见基因突变或其他因素导致耐药没有鉴定能力[17-18];少量非优势耐药菌群活性差，利用RFP杀灭不活跃MTB可能要延长药物作用时间后才能进行SAT-TB检测，可能需要尝试联合其他实用、经济的检测技术或者优化相关检测流程来完善检测方案。总之，对于缺少像BACTEC MGIT960这种快速检测MTB药敏表型药敏检测仪器的基层单位，Xpert MTB/RIF联合SAT检测可以成为快速精准诊断RFP异质性耐药优选方案之一。

参考文献

[1] World Health Organization.Treatment Guidelines for Drug-resistant Tuberculosis[S].2016 Update.WHO/HTM/TB/2016.04.Geneva：World Health Organization，2016.

[2] Herve C，Bergot E，Veziris N，et al.Tuberculosis in 2015：From diagnosis to the detection of multiresistant cases[J].Rev Mal Respir，2015，32（8）：784-790.

[3]郭苏珊，林健雄，郭金镇，等.BACTEC MGIT 960用于结核分枝杆菌直接药敏试验的研究[J].中国病原生物学杂志，2014，9（10）：946-948，952.

[4]刘亚芹，杨振斌，冯冬霞，等.GeneXpert法检测结核分枝杆菌及其对利福平耐药性的研究[J/OL].中华实验和临床感染病杂志：电子版，2015，9（4）：524-527.

[5] Walters Elisabetta，van der Zalm Marieke Magrieta，Palmer Megan， et al.

Xpert MTB/RIF on stool is useful for the rapid diagnosis of tuberculosis in young children with severe pulmonary disease[J].The Pediatric Infectious Disease Journal，2017，36（9）：837-843.

[6]陈俊林，黄飞，徐费凡，等.Xpert MTB/RIF与BACTEC MGIT960检测结核分枝杆菌及利福平耐药差异性[J].中国医药导报，2018，15（1）：49-52.

[7]中國防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程[M].北京：中国教育文化出版社，2006.

[8]程松，李园园，陆俊梅，等.RNA恒温扩增实时检测技术对结核分枝杆菌利福平耐药性的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2014，37（5）：328-331.

[9]高旭，李静，柳清云，等.异质性耐药对结核分枝杆菌表型和基因型耐药检测结果的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2014，37（4）：260-265.

[10] Sah A K，Joshi B，Khadka D K，et al.Comparative study of GeneXpert MTB/RIF assay and multiplex PCR assay for direct detection of mycobacterium tuberculosis in suspected pulmonary tuberculosis patients[J].Curr Microbiol，2017，74（9）：1026-1032.

[11]徐礼锋，余旭良，张锋，等.液体MGIT培养联合XpertMTB/RIF快速检测结核分枝杆菌及其耐药性研究[J].中华检验医学杂志，2016，39（4）：272-276.

[12]纪丽微，林健雄，彭东东，等.Xpert MTB/RIF技術用于结核分枝杆菌联合检测的研究[J].国际检验医学杂志，2017，38（10）：1391-1394.

[13] Mathys V，van de Vyvere M，de Droogh E，et al.Positive rifampicin resistance on Xpert MTB/RIF caused by a silent mutation in the rpoB gene[J].Int J Tuberc Lung Dis，2014，18（10）：1255-1257.

[14]葛燕萍，张青.痰标本RNA恒温扩增技术对活动性肺结核的临床诊断价值[J].中国防痨杂志，2016，38（9）：742-746.

[15]罗贤，张腊红，洪理泉，等.恒温扩增实时荧光检测技术在肺结核患者诊断中的应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，2015，29（2）：183-185.

[16] Cui Z，Li Y，Cheng S，et al.Direct identification and discernment of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare using a real-time RNA isothermal amplification and detection method[J].Tuberculosis，2015，95（6）：764-769.

[17] Somoskovi A，Deggim V，Ciardo D，et al.Diagnostic implications of inconsistent results obtained with the Xpert MTB/Rif assay in detection of Mycobacterium tuberculosis isolates with an rpoB mutation associated with low-level rifampin resistance[J].J Clin Microbiol，2013，51（9）：3127-3129.

[18]张爱梅，李锋，刘旭晖，等.结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测在肺外结核中的诊断价值[J].中华传染病杂志，2016，34（3）：174-179.

（收稿日期：2019-10-21） （本文编辑：何玉勤）