注意缺陷多动障碍患儿的肠道菌群特征

张 珊 万 林 孙于林 杨 光

解放军总医院第一医学中心儿内科（北京 100853）

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）是一种神经精神类疾病，学龄期儿童多发，主要表现为注意力不集中伴或不伴有冲动和多动的症状[1]。ADHD发病机制可能与神经递质失调相关，例如多巴胺、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及去甲肾上腺素等激素水平的异常表达[2-4]。也有遗传学检测发现，多巴胺、去甲肾上腺素以及5-HT相关基因在ADHD患儿中存在异常表达[5-7]。另有研究表明，肠道菌群可能与神经系统疾病相关，例如阿尔茨海默病、癫痫、孤独症等[8-9]。目前研究提示，在人体中存在微生物-肠-脑轴的双向调节机制，肠道微生物的代谢产物，影响神经递质的分泌，从而影响脑部功能，同时神经系统亦可反向调节肠道微生物的构成，这种双向调节是通过复杂的神经-内分泌通路所完成的[10]。而肠道菌群可以通过神经递质、炎性因子及下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA）轴等来调节这一通路[11]。因此肠道菌群的异常构成，可能会导致神经递质异常分泌，从而促发神经精神疾病的发生。本研究拟采用病例对照研究方法，分析ADHD 患儿与健康对照儿童的肠道菌群构成差异，进一步探讨ADHD 的发病机制，为ADHD治疗探索潜在的新方法。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2019 年1 月至2019 年6 月在解放军总医院第一医学中心儿科门诊就诊的ADHD 患儿作为研究对象。入组标准：①年龄6～12 岁；②首次确诊为ADHD[12]；③近1 个月内无呼吸道及消化道感染史；④近1个月内无益生菌服用史；⑤无消化系统疾病或其他慢性病史；⑥BMI＜18；⑦无过敏性疾病，如过敏性鼻炎，哮喘等；⑧无ADHD治疗药物服用史。

同期征集6～12岁非ADHD无特殊疾病儿童作为对照。入组标准为：①年龄6～12 岁；②完成儿童情感障碍与精神分裂症定式检查问卷终生版（Kiddie-SADS-Present and Lifetime Version scale，K-SADS-PL）中的多动和注意力量表调查后，结果非ADHD 者；③～⑦同ADHD患儿。

本研究经解放军总医院伦理委员会批准。所有入组研究对象及家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 ADHD组和对照组儿童均在入组后留取大便样本，置于-80℃冰箱留存待测。

1.2.2 ADHD诊断与评估 对就诊的疑似ADHD儿童，进行K-SADS-PL 量表中的多动和注意力量表调查，依据评分标准判断是否符合ADHD临床表现。而后由儿童神经精神类疾病专科医师根据儿童症状表现及相应检查结果，参照美国精神病协会（American Psychiatric Association，APA）制定的《精神疾病诊断与统计手册》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-Ⅳ）中的ADHD诊断标准进行诊断。

1.2.3 粪便宏基因组检测 称取约20 mg粪便到研磨管中，并加入750 μL 缓冲液，使用匀浆仪对粪便样本进行研磨，然后离心（10 000×g，离心1 分钟）。取上清后按说明书进行粪便DNA 提取。采用鸟枪法宏基因组测序技术对标本中微生物进行全基因组测序。使用Bead-Beating 进行菌体破裂，HiPure Stool DNA kit 进行DNA 提取，Qubit 4.0 进行质检。随后采用KAPA Hyper Prep Kit 试剂盒进行文库构建，在Illumina NovaSeq 平台进行双端测序，序列读长为150 bp，即PE150。使用KneadData对所有宏基因组测序数据进行数据预处理。KneadData采用Trimmomatic子模块进行结构引物序列、低质量短读框序列以及嵌合体序列等的筛除。随后使用Bowtie2将测序序列与人类基因组序列进行比对以去除宿主基因，使用的参考基因序列为hg19版本。

1.2.4 菌群多样性及菌属分析 对完成预处理的测序序列，采用HUMAnN2 进行物种丰度的分析。先使用MetaPhlAn2将序列与事先建立好的核心基因比对，快速定位出菌群中所包含的物种；然后再将序列与定位出的物种的泛基因组进行比对，以明确微生物属种。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据处理。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以百分比表示，组间比较采用Fisher精确概率法检验。使用主成分分析与置换多因素方差分析对属水平物种丰度进行检验。物种丰度分组间比较采用Wilcoxon秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。在属和种水平上的丰度分析，另采用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）效应值LEfSe方法来确定多动症儿童特有的肠道微生物特征，LDA＞2为差异具有统计学意义。同时通过计算基因丰度的熵值确定Shannon、Simpson及Chao1指数以分析菌群α多样性。

2 结果

2.1 一般情况

共纳入ADHD 患儿17 例，其中男14 例、女3例，中位年龄8（7～9.5）岁；健康儿童17 例，其中男13 例、女4 例，中位年龄8（7～10）岁。两组间性别（P=1.000）及年龄（Z=0.25，P=0.799）的差异均无统计学意义。

2.2 菌群差异性分析

ADHD 患儿与健康儿童肠道微生物α 多样性Shannon 指数分别为9.79（9.27～10.01）和9.55（9.29～9.61），Simpson指数分别为0.92（0.88～0.95）和0.89（0.88～0.91），Chao1指数分别为62.0（55.0～72.0）和56.0（53.0～72.0），两组间各指数差异均无统计学意义（Z=1.22、1.19、0.24、P均＞0.05）。见图1。

在属水平上，对ADHD患儿与健康儿童微生物物种相对丰度进行主成分分析与置换多因素方差分析检验后显示，无法将其有效区分，两组间无明显差异（P=0.223）。见图2。

ADHD 组粪肠杆菌属Faecalibacterium及韦荣球菌属Veillonellaceae丰度较低（Z=3.15、P=0.002，Z=2.11、P=0.035），而气味杆菌属Odoribacter丰度较高（Z=2.11、P=0.035）。行LEfSe检验提示，除上述差异外，可见肠球菌属Enterococcus在ADHD患儿中显著增高（LDA＞2）。见图3。

图1 菌群α 多样性分析

图2 属水平多动症患者与健康人的主成分分析与置换多因素分析

图3 菌属及种水平ADHD 患儿与健康儿童差异图

种水平的LDA 结果显示，ADHD 患儿的臭味菌科（Odoribacteraceae）和肠杆菌科（Enterocaccaceae）显著增加，而瘤胃菌科（Ruminococcaceae）显著减少（LDA＞2）。见图3。在种水平上，行秩和检验显示，ADHD 患儿的普氏栖粪杆菌Faecalibacterium prausnitzii、毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium、小韦荣球菌Veillonella parvula以及活泼瘤胃球菌Ruminococcus gnavus丰度显著降低（Z=2.91、P=0.004，Z=2.44、P=0.015，Z=2.14、P=0.032，Z=2.35、P=0.019），粪拟杆菌Bacteroides caccae、内脏拟杆菌Odoribacter splanchnicus以及木假单胞菌Paraprevotella xylaniphila丰度显著增高（Z=2.41、P=0.016，Z=2.12、P=0.029，Z=2.12、P=0.034）。

3 讨论

肠道作为哺乳动物体内最大的生态系统，有超过100 万亿个微生物，可影响宿主的生理功能[13]。微生物-肠-脑轴这一理论的提出表明，肠道菌群与大脑存在双向调节机制，具有复杂的神经-内分泌通路。既往报道，患有ADHD 的儿童可能存在神经递质异常，而肠道菌群有可能通过神经内分泌通路调节神经递质的水平[14]。

本研究中，ADHD患儿肠道菌群与健康儿童相比存在明显差异。与以往文献报道[15]相同，本研究中ADHD患儿与健康儿童的肠道菌群α多样性一致，在具体菌属等水平上可见粪肠杆菌属明显减低。但与以往报道不同的是，本研究中ADHD患儿的韦荣球菌属明显减低，而肠球菌属、气味杆菌属明显增高；在菌种水平上还发现ADHD患儿的普氏栖粪杆菌、毛螺科菌以及活泼瘤胃球菌显著较少，粪拟杆菌、内脏拟杆菌、木假单胞菌以及小韦荣球菌则显著增多。

ADHD作为一种神经精神类疾病，其发病机制目前仍未完全探明。既往研究指出，神经递质水平的异常表达参与了发病过程[16]。基于此种理论，临床中常用的治疗药物主要为中枢神经系统兴奋剂，如盐酸哌甲酯等，其作用机制可能为通过抑制突触间隙对多巴胺的再摄取，从而提高多巴胺水平，对症状进行控制，但临床治疗效果不一[17]。

既往研究表明，肠道菌群通过微生物-肠-脑机制，参与了神经类疾病的致病过程，其中包括阿尔茨海默病、癫痫、孤独症谱系障碍及抽动障碍等[9,16,18]。研究表明，早期肠道菌群的形成可影响大鼠的神经系统发育，造成其成熟后的焦虑行为等心理健康问题，如给予孕期母鼠低剂量抗生素处理后，可导致其肠道菌群失调，进而引起其后代的生理行为改变[18-20]。将精神分裂患儿的肠道菌群移植到无菌小鼠体内后，可导致小鼠出现相应的精神症状，而此种效应的产生与菌群调节神经递质谷氨酰胺-谷氨酸-GABA通路相关[21]。将帕金森患者的肠道菌群移植到无菌帕金森模型小鼠肠道内后，小鼠的运动症状明显加重，而给予抗生素处理后，这一症状得到纠正[22]。

在本研究中，ADHD患儿存在粪肠杆菌属低表达。而在以往的动物和人类研究中可以观察到，粪肠杆菌属低表达可能导致各种疾病的发生，例如哮喘、湿疹和过敏性鼻炎等[23]，同时，具有过敏体质的儿童患ADHD 的风险增加30%～50%[24]。由此可推测，这一菌属的低表达可能导致过敏发生，同时通过脑-肠-轴影响神经递质的释放，进而导致ADHD。另有研究表明，高脂、高蛋白、高糖饮食更容易引发ADHD，而这种饮食可导致粪肠杆菌属低表达[25]，两者之间存在着相关性。粪肠杆菌属具有抗炎作用，其表达水平降低，可能导致炎性因子表达增加[26-27]，而ADHD患儿炎性因子水平有明显增高[28]，炎性因子可通过血脑屏障从而影响神经系统发育以及脑部功能[29]。因此，可推测粪肠杆菌属失调而引起的炎症因子的变化，可能也参与了ADHD的发病。

同时，本研究中ADHD 患儿的肠球菌属明显增高，而已有报道肠球菌属与神经递质紧密相关。研究表明，肠球菌属与血清素转运体相关，血清素转运体缺乏的小鼠可见肠球菌属明显增高[30]，而血清素转运体缺乏通过降低5-HT 水平，而导致ADHD 发病[31]。近期有研究指出，肠球菌属可以导致帕金森的一线治疗药物左旋多巴在外周过多地转换为多巴胺，但由于血脑屏障，导致外周多巴胺无法进入中枢神经系统；同时肠球菌属的异常增高，还导致酪氨酸脱羧酶的过度激活，使酪氨酸及苯丙氨酸的脱羧化反应加剧，无法有效进入中枢神经系统转化为多巴胺前体左旋多巴。以上两条途径均可使中枢神经系统内多巴胺浓度减低，从而导致帕金森症状加剧[32]。而既往大量研究均表明，ADHD发病与中枢神经系统多巴胺减少相关[3,33-34]。因此，本研究所呈现的肠球菌属增高可能通过以上作用机制，导致颅内多巴胺减少而诱发ADHD。另外，本研究中ADHD 患儿的气味杆菌属明显增高。气味杆菌属Odoribacter也与神经精神疾病密切相关。儿童急性发作神经精神综合征（pediatric acute onset neuropsychiatric syndrome，PANS）与链球菌感染相关性小儿自身免疫性神经精神障碍（pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infectoins，PADANS）患儿与健康儿童相比，肠道菌群中的气味杆菌属显著增高；经相关软件预测后，发现PANS及PANDAS患儿的多巴胺代谢通路明显下调，同时气味杆菌属相对丰度的比例高低与抗链球菌溶血素O效价呈明显正相关[35]，提示气味杆菌属可能导致多巴胺代谢通路的异常从而导致ADHD发病。

本研究严格设置了ADHD 患儿的入组及排除标准，同时纳入健康儿童作为对照，并对纳入的健康儿童进行了ADHD量表评估，以排除潜在的ADHD患儿。但本研究存在样本量小，未考虑饮食差异等问题，将在下一步研究中予以完善。

综上可推测，肠道菌群结构的变化，可能导致微生物-肠-脑轴的功能失调，从而使神经内分泌通路失衡，进而导致ADHD的发病。