祛寒逐风颗粒质量标准研究

李喜香 张志瑞 毕映燕 张亚会 李季文 王雪梅

摘要：目的  通过对祛寒逐风颗粒进行定性鉴别、定量分析，建立该制剂的质量控制方法。方法  参照《中华人民共和国药典》方法，对秦艽、威灵仙及毒性成分乌头碱进行定性鉴别;采用Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，波长275、322 nm，同时测定龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A含量;采用Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，以乙腈-0.1%磷酸（90∶10，V/V）水溶液为流动相，波长210 nm，测定齐墩果酸含量。结果  薄层色谱斑点清晰，专属性强，分离度高，阴性无干扰，能有效鉴别秦艽、威灵仙，并对乌头碱进行限量检查。龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A、齐墩果酸分别在0.686～6.86 μg（r=0.999 4）、0.013 4～0.134 μg（r=0.999 6）、0.016～0.16 μg（r=0.999 6）、0.002～0.02 μg（r=0.999 0）、0.011～0.088 μg（r=0.999 5）范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为99.90%、99.44%、99.14%、97.74%、95.32%，RSD分别为1.49%、2.69%、2.24%、1.61%、2.79%。结论  本研究建立的方法简便、准确，稳定性、重复性好，可用于祛寒逐风颗粒的质量控制。

关键词：祛寒逐风颗粒;龙胆苦苷;阿魏酸;藁本内酯;欧当归内酯A;齐墩果酸;薄层色谱法;高效液相色谱法

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）02-0053-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907354

Study on Quality Standard of Quhan Zhufeng Granules

LI Xixiang， ZHANG Zhirui， BI Yingyang， ZHANG Yahui， LI Jiwen， WANG Xuemei

Gansu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China

Abstract： Objective To establish the method for quality control of Quhan Zhufeng Granules through qualitative identification and quantitative analysis. Methods According to Chinese Pharmacopoeia， the qualitative identification methods of Gentianae Macrophyllae Radix， Clematidis Radix et Rhizoma and the toxic components of aconitine were established. With Waters Symmetry C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）， the column temperature of 25 ℃， the flow rate of 1.0 mL/min， the injection volume of 10 μL， mobile phase of methanol-0.1% phosphoric acid aqueous solution; the wavelengths of 275， 322 nm， the contents of gentiopicrin， ferulic acid， ligustilide and angelica lactone A were determined simultaneously. With Waters Symmetry C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）， the column temperature of 30 ℃， the flow rate of 1.0 mL/min， the injection volume of 10 μL， the mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （90：10， V/V） aqueous solution， the wavelength of 210 nm， the content of oleanolic acid was determined. Results TLC spots were clear， specific， highly separated， negative and no interference， which could effectively identify Gentianae Macrophyllae Radix， Clematidis Radix et Rhizoma and aconitine. Gentiopicrin， ferulic acid， ligustilide， Angelica lactone A and oleanolic acid were in a good linear relationship in the range of 0.686?6.86 μg （r=0.999 4）， 0.013 4?0.134 μg （r=0.999 6）， 0.016?0.16 μg （r=0.999 6）， 0.002?0.02 μg （r=0.999 0）， 0.011?0.088 μg （r=0.999 5）， respectively. The average recovery rates were 99.90%， 99.44%， 99.14%， 97.74% and 95.32%， respectively， and RSD were 1.49%， 2.69%， 2.24%， 1.61%， 2.79%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate， stable and reproducible， and can be used for the quality control of Quhan Zhufeng Granules.

Keywords： Quhan Zhufeng Granules; gentiopicrin; ferulic acid; ligustilide; angelica lactone A; oleanolic acid; TLC; HPLC

祛寒逐风方是在武威汉代医简“伤寒逐风方”的基础上结合临床应用加减而成的经验方，由黑顺片、制川乌、秦艽、威灵仙、毛细辛、花椒、麸炒白术、泽泻、制龟甲、制鳖甲、川芎组成，具有温经活络、除湿消肿、活血止痛和益肾强筋功效，主治风湿性关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、肩周炎和颈椎病等风寒湿痹证。临床研究显示，该方疗效确切[1-2]。为方便临床使用，减少患者服用剂量，结合药效学及安全性指标，本院将其研制为祛寒逐风颗粒（甘药制字Z20190001）。本研究采用薄层色谱法建立秦艽、威灵仙的定性鉴别方法，对黑顺片、制川乌中毒性成分乌头碱进行限量检查，采用HPLC测定龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A、齐墩果酸含量，为该制剂的质量控制提供依据。

1  仪器与试药

Altus-A10高效液相色谱仪、Empower3工作站，美国珀金埃尔默仪器有限公司;ZDHW型调温电热套，北京科伟永兴仪器有限公司;DZF-300型真空恒温干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;360EP型、125SM型电子天平，德国Satorius公司;SB-320DTDN型超声波清洗器，宁波新芝生物科技有限公司;G型、G254型薄层层析硅胶板，青岛化工有限公司;HH-S4型电热恒温水浴锅，郑州长城科工贸易有限公司;LA753型实验室纯化水机，威立雅水务设备安装工程（上海）有限公司;DD70型薄层色谱成像系统，大昌华嘉商业（中国）有限公司;RE-3000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

秦艽对照药材（批号121199-201003）、川芎对照药材（批号120918-201411），中国食品药品检定研究院;毛细辛（批号180502），购于甘肃陇脉有限公司，经甘肃省食品药品检定研究院宋平顺主任药师鉴定为马兜铃科植物汉城细辛的全草;藁本内酯对照品（批号4431-01-0），上海安谱实验科技股份有限公司;对照品龙胆苦苷（批号110770-201716）、齐墩果酸（批号110709-201607）、阿魏酸（批号110773-201614）、欧当归内酯A（批号111826-201605），中国食品药品检定研究院;祛寒逐风颗粒（15 g/袋，批号181001、181002、181003），本院制剂室制备。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸等试剂为分析纯，天津市大茂化学试剂厂;水为超纯水（LA753型实验室纯化水机制备）。

2  方法与结果

2.1  定性鉴别

2.1.1  秦艽

取本品10 g，研细，加入甲醇20 mL，超声处理30 min，摇匀，过滤，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液。分别取秦艽对照药材3 g、缺秦艽阴性样品9 g，同法制备对照药材溶液和阴性对照溶液。照薄层色谱法[2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0502]试验，分别吸取上述溶液各10 μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（10∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视[3]，结果供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.1.2  威灵仙

取本品10 g，研细，加乙醇50 mL，加热回流2 h，过滤，滤液浓缩至20 mL，加盐酸3 mL，回流提取1 h，加水10 mL，放冷，加石油醚（60～90 ℃）25 mL，振摇提取，分取石油醚层，蒸干，残渣用无水乙醇2 mL溶解，作为供试品溶液。精密称取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺威灵仙阴性样品9 g，同法制备阴性对照溶液。照薄层色谱法[2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0502]试验，分别吸取上述溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶3∶0.2）为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和30 min，展开，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下观察[4-5]，结果供试品色谱在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。

2.1.3  乌头碱

取本品45 g，加70 mL水，超声溶解40 min，过滤，滤液加氨试液4 mL，摇匀，放置2 h，加乙醚90 mL，振摇1 h，放置24 h，分取乙醚层，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。精密称取乌头碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺制川乌、黑顺片阴性样品8 g，同法制备阴性对照溶液。照薄层色谱法[2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0502]试验，精密吸取对照品溶液5 ?L，供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺（6∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，结果供试品色谱在与对照品色谱相应位置上出现的斑点小于对照品的斑点或不出现斑点，阴性对照无干扰。

2.2  龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A定量分析

2.2.1  色谱条件

采用Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸，梯度洗脱程序见表1，检测波长分别为275、322 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL[6-8]。

2.2.2  溶液制备

2.2.2.1  混合对照品溶液

精密称取龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A对照品适量，加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷1.372 mg、阿魏酸0.026 8 mg、藁本内酯0.032 mg、欧当归内酯A 0.004 mg的混合溶液，摇匀，即得。

2.2.2.2  对照品溶液

精密称取龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷1.368 mg、阿魏酸0.026 4mg、藁本内酯0.029 8 mg、欧当归内酯A 0.003 6 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2.3  供试品溶液

精密称取本品5 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，取续滤液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2.4  阴性对照溶液

取除秦艽、毛细辛、川芎外的祛寒逐风颗粒处方饮片，按制备工艺制成阴性样品，并按“2.2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.3  专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，结果见图1。对照品溶液和供试品溶液在相同保留时间处均有色谱峰，分离度良好，理论塔板数均不低于3000，阴性对照无干扰。

2.2.4  线性关系考察

精密吸取“2.2.2.1”项下混合对照品溶液1.25、2.5、5、10、12.5 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合对照品溶液。精密吸取系列混合对照品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品质量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A的回归方程，结果见表2。

2.2.5  精密度试验

取“2.2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测得龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A峰面积RSD分别为1.08%、1.28%、1.54%、0.78%，表明仪器精密度良好。

2.2.6  重复性试验

精密称取同一样品（批号181003）6份，按“2.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A含量的RSD分别为0.30%、1.27%、1.77%、1.37%，表明该方法重复性良好。

2.2.7  重现性试验

精密称取同一样品（批号181003）6份，选用不同的仪器，按“2.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A含量的RSD分别为0.65%、1.32%、1.85%、1.42%，表明该方法重现性良好。

2.2.8  稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置0、4、8、12、18、24 h，分别按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A峰面积RSD分别为0.87%、1.78%、0.70%、1.59%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9  加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号181003）1 g，共6份，分别加入“2.2.2.2”项下龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A对照品溶液各3.8、0.8、1.0、0.7 mL（按含量的100%加入），按“2.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A加样回收率及RSD，结果见表3。

2.3  齐墩果酸定量分析

2.3.1  色谱条件

采用Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸（90∶10，V/V），流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL[9]。

2.3.2  溶液制备

2.3.2.1  对照品溶液

精密称取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.022 mg的溶液，搖匀，即得。

2.3.2.2  供试品溶液

精密称取本品5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50 mL，回流提取2 h，过滤，滤液浓缩至20 mL，加盐酸3 mL，加热回流1 h，加水10 mL，放冷，加石油醚（60～90 ℃）25 mL，振摇提取，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇溶解，转移并定容至10 mL容量瓶，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得[9]。

2.3.2.3  阴性对照溶液

取除威灵仙外的处方饮片，按制备工艺制成阴性样品，按“2.3.2.2”项下方法制备，即得。

2.3.3  专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果见图2。对照品溶液和供试品溶液在相同保留时间处均有色谱峰，分离度良好，理论塔板数不低于3000，阴性对照无干扰。

2.3.4  线性关系考察

精密吸取“2.3.2.1”项下对照品溶液1.25、2.5、5、7.5、10 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成浓度分别为0.001 1、0.002 2、0.004 4、0.006 6、0.008 8 mg/mL的对照品溶液，精密吸取上述系列对照品溶液各10 μL，按“2.3.1”项下色谱条件进样。以峰面积为纵坐标，对照品质量（μg）为横坐标绘制标准曲线，得齐墩果酸回归方程为Y=1×106X-361.99（r=0.999 2），表明齐墩果酸在0.011～0.088 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5  精密度试验

取“2.3.2.1”项下对照品溶液10 μL，连续进样6次测定，结果齐墩果酸峰面积RSD=1.06%，表明仪器精密度良好。

2.3.6  重复性试验

精密称取同一样品（批号181003）6份，按“2.3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果齐墩果酸含量RSD=0.59%，表明该方法重复性良好。

2.3.7  重现性试验

精密稱取同一样品（批号181003）6份，选用不同的仪器，按“2.3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果齐墩果酸含量的RSD=0.85%，表明该方法重现性良好。

2.3.8  稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置0、4、8、12、18、24 h，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果齐墩果酸峰面积RSD=1.14%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9  加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号181003）5 g，共6份，分别加入齐墩果酸对照品2 mL（按含量的100%加入），按“2.3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率和RSD，结果见表4。

2.4  样品含量测定

取样品适量，分别按供试品制备方法处理，并按上述色谱条件进样测定，测得3批样品中龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A和齐墩果酸含量，结果见表5。

3  讨论

祛寒逐风颗粒处方以黑顺片、制川乌为君药，二药同用，通十二经，走里达表，有温经祛寒、逐风除湿、通络止痛之功效。配伍威灵仙、秦艽、细辛、花椒辛散温通之品为臣药，以散久蕴之寒，通六郁之阴滞。佐白术、泽泻，升清降浊，健脾利湿，顾护中焦，驱邪利浊;风寒湿痹日久，必累及肝肾，筋骨失养，佐制龟甲、制鳖甲，补肾健骨，软坚散结，且可制约君药的燥热伤阴之弊。使川芎，意在行气活血通络。诸药合用，共奏温经活络、除湿消肿、活血止痛、益肾强筋之功。

研究表明，秦艽所含的龙胆苦苷对炎症早期渗出具有一定的抑制作用，具有抗炎、镇痛、保肝、免疫抑制、降血压、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[10]。威灵仙所含的三萜皂苷类成分齐墩果酸具有抗炎作用[11]。川芎中的藁本内酯等抗炎活性较好，有机酸类化合物阿魏酸具有抑制血小板聚集、增强免疫功能等药理作用[12-13]。综合考虑，本试验采用龙胆苦苷、齐墩果酸、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A作为含量测定的指标成分，并建立了同时测定龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A含量的方法。

在进行含量测定时，对有效成分的提取溶剂和提取方法进行筛选。用50 mL甲醇超声提取30 min时，龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯和欧当归内酯A提取效果较好，但未检测到齐墩果酸。考虑到齐墩果酸溶于乙醇且能在酸中水解的性质[14]，用乙醇和盐酸加热回流、石油醚振摇提取，效果较好，但其他4种有效成分含量较低。因此，本试验分别采用不同方法测定齐墩果酸和其余4种成分的含量。

本试验分别考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸作为流动相的分离效果。流动相为前者时，龙胆苦苷等4种有效成分分离效果较好，峰形较好;流动相为后者时，齐墩果酸分离效果较好。因此，最终确定以甲醇-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，测定龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A的含量;以乙腈-0.1%磷酸为流动相等度洗脱，测定齐墩果酸的含量。结果表明测定方法稳定、可靠。

在190～800 nm进行全波长扫描，发现龙胆苦苷、阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A最大吸收波长分别为275、322、327、280 nm，龙胆苦苷、欧当归内酯A在波长322、327 nm处的峰面积较小，故选择275 nm作为二者的测定波长;阿魏酸、藁本内酯的吸收度在波长322 nm和327 nm处基本一致，且峰面积大于波长275 nm处，故选择322 nm作为阿魏酸、藁本内酯的测定波长。

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（收稿日期：2019-07-23）

（修回日期：2019-08-22;编辑：陈静）

基金项目：中医药行业科研专项（201507001）