近红外光谱法测定尼莫地平片剂尼莫地平含量的4个分析模型所给出的预测值的准确性的比较

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(嘉应学院 化学与环境学院,梅州514015)

市售的尼莫地平片的种类繁多,尼莫地平的含量可能存在与标示值不一致的情况。目前测定尼莫地平含量的方法主要有高效液相色谱法[3-4]、超高效液相色谱-串联质谱法[5]、一阶导数光谱法[6]、紫外分光 光 度 法[7]、滴 定 法[8]、方 波 伏 安 法[9]等。2015版《中华人民共和国药典》中尼莫地平含量的测定方法为高效液相色谱法[10],该方法灵敏度高,但存在操作复杂、耗时较长、成本高,溶剂用量大等问题,难以完成大批量药品的检测任务。方波伏安法具有快速、测定结果准确、重现性好等特点,但是此方法采用的非水溶剂为危险品,对人体伤害较大。

近红外光谱法是一种简便、准确、快速、无损、无污染的快速分析检测技术[11-17],近年来在药物分析领域应用广泛。近红外光谱配有积分球分析模块、片剂分析模块、光纤分析模块等多种不同的采样模块,可采集不同形式的近红外光谱图,利用这些不同的近红外光谱图,可对一种研究对象建立多种分析模型。在近红外分析中,哪种采样模块所建模型的效果更佳;不同采样模块所建模型的利弊;不同模型的适用范围,这些都是值得关注的问题。

本工作采用积分球分析模块采集了尼莫地平片样品片状和粉末状漫反射近红外光谱图,分别建立了药片近红外光谱漫反射定量分析模型和药粉近红外光谱漫反射定量分析模型;采用片剂分析模块采集了尼莫地平片反射近红外光谱图和透射近红外光谱图,分别建立了药片近红外光谱反射定量分析模型和药片透射近红外光谱定量分析模型。对4种模型的预测准确性进行了比较,找出预测尼莫地平含量准确性最高的近红外光谱定量分析模型,得到一种测定尼莫地平含量的方法。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

AntarisⅡ型傅里叶变换近红外光谱仪,附积分球固体采样模块、片剂分析模块、铟镓砷(InGa As)检测器、TQ Analyst 9．0 光 谱 分 析 软 件;SS-01 型Super-Shark IR 振荡机;岛津 LC-20AT 型高效液相色谱仪。

尼莫地平对照品纯度为98．5%;市购10个不同药厂的尼莫地平片,共13个批次的尼莫地平片(其中3个厂家分别购买了2个不同批次,7个厂家各购买了1 个批次)。选用其中的不同药厂生产的10个批次尼莫地平片为建模样品,余下3个批次尼莫地平片用于外部验证以评价所建不同定量分析模型的优劣。

1．2 仪器工作条件

1)积分球分析模块以空气为背景;设置波数范围10 000～4 000 cm－1;扫描次数64 次;分辨率8 cm－1。

2)片剂分析模块以空气为背景;设置波数范围10 000～4 000 cm－1;扫描次数32 次;分辨率8 cm－1。

排除标准：(1)术前检查发现内科疾病者；(2)对镇痛类药物过敏者；(3)发现腕管内肿瘤压迫者或伴有术前急慢性感染者。

1．3 试验方法

1．3．1 积分球分析模块测定尼莫地平药片

从10个厂家的每一种样品取5个样本,装入样品杯,测定其样本的漫反射近红外光谱图。每个样本按同样方法测3张谱图,取平均值作为样本谱图。将积分球分析模块测定的片状样本的近红外漫反射光谱导入TQ Analyst 9．0软件中,用一阶导数谱图建模,选偏最小二乘法(PLS),光程选多元信号修正(MSC),建 模 波 段 同 时 选 4 773．46 ～4 816．80 cm－1,4 952．30 ～ 5 214．57 cm－1,6 020．67～6 082．38 cm－1等3个波段;并使用诺里斯导数滤噪:节段长度(7)、段间间隙(6)方式降噪。建立了积分球分析模块采样的尼莫地平片近红外漫反射定量分析模型(模型1)。每种样品的4个样本的谱图进行建模(共40 个),余下1 个样本(共10个)的谱图用作内部验证。模型交叉验证选择的潜变量数为1。

1．3．2 积分球分析模块测定尼莫地平药粉

从10个厂家的每一种样品任取5片药,用振荡机振荡成粉末,振荡机的转速为4 000 r·min－1,振荡时间为1 min,重复操作,得5个粉末样本。将样品药粉置于积分球样品杯中测定其样本的漫反射近红外光谱图,每个样本按上述方法测3张谱图,取平均值作为样本谱图。将积分球分析模块测定的药粉样本的近红外漫反射光谱导入TQ Analyst 9．0软件中,用二阶导数谱图建模,波段为4 009．51～4 493．33 cm－1,5 746．75～6 092．23 cm－1,并采取诺里斯导数滤噪:节段长度(11)、段间间隙(1)降噪,其他条件均和1．3．1 节中定量分析模型的方法一致,建立了尼莫地平药粉近红外漫反射定量分析模型(模型2)。

1．3．3 片剂分析模块测定尼莫地平片

从10个厂家的每一种样品中取5片药,分别将药片夹至采样窗口,同时采集其样本的近红外反射光谱图和透射光谱图。每个样本按上述方法各测3张近红外反射光谱和透射光谱图,分别取平均值作为样本的近红外反射光谱和透射光谱图。将片剂分析模块测定的药粉样本的近红外漫反射光谱导入TQ Analyst 9．0软件中,近红外反射光谱按照二阶导数谱图建模,波段为4 010．34～4 467．61 cm－1,5 124．90～6 115．59 cm－1,并采取萨维戈莱多项式滤噪:数据点(3)、多项式阶(6)降噪;近红外透射光谱用一阶导数光谱建模,波段为4 001．22～4 444．89 cm－1,5 876．27～6 070．81 cm－1,并采取萨维戈莱多项式滤噪:数据点(3)、多项式阶(6)降噪;其他条件均和1．3．1 节中定量分析模型的方法一致,建立了尼莫地平药片近红外反射定量分析模型(模型3)和近红外透射定量分析模型(模型4)。

1．3．4 参比方法

以2015版《中华人民共和国药典》中的高效液相色谱法(HPLC)为参比方法对剩下3个生产厂家与建模样品相同批次的3种样品共15个样本进行尼莫地平片中尼莫地平含量的测定,对所建模型进行外部验证,以评价所建不同定量分析模型的优劣。

2 结果与讨论

2．1 HPLC测定结果

市购10个不同药厂,共13个批次尼莫地平片经HPLC检测,各不同批次的尼莫地平片含尼莫地平的质量分数为5%～25%,所含尼莫地平的含量均为药片标示值的90%～110%[注:标示值由每片含主药尼莫地平的量(mg),换算成由单位片重(g)中所含的尼莫地平质量(g),以表征片剂中尼莫地平的含量(%)]。

2．2 近红外光谱

按试验方法使用不同的分析模块对采集13个批次的尼莫地平片的药片或药粉进行近红外光谱测定,同一分析模块,每一个样本取一张谱图,放在一起进行比较,药粉或药片的近红外分析结果的谱图见图1。

图1 尼莫地平药片或药粉的近红外光谱Fig．1 Near infrared spectra of nimodipine tablets and powder

由图1(a)可知:13张谱图没有完全重叠,说明即使是同一厂家的同一批次中的不同样本药,其谱图也存在差异,13张谱图不能完全重合,这是因为药片样本谱图不仅受药片主成分尼莫地平的含量、辅料成分及其含量的影响,也受药片的形状、药片的大小、样品杯中样品堆积的紧密程度等外在因素的影响,导致谱图发生偏移。

图1(b)中药粉谱图的重合度最高,因样本为颗粒细小、均匀的粉末,消除了上述外界因素的影响。

图1(c)、图1(d)中药片谱图的重合度较高,药片分析模块测定尼莫地平药片的反射谱图和透射谱图是同时测定的,二者谱图的重合度相近,虽然样品测定时采用的是单片药,不存在样品堆积的紧密程度的问题,但仍受药片的均匀度、药片的大小等影响,同一批次药品的谱图也存在一定的差异。

2．3 不同的近红外光谱所建4种定量分析模型

按1．3节的试验方法进行建模,通过对模型的内部验证、交叉验证[在所有参与建模样品中,每次选“1”个样品,作为临时验证样品(而不是一个变量)进行交叉验证]等方式优化模型参数。

以模型的校正均方差(RMSEC)、校正相关系数(Rc)、预测均方差(RMSEP)、预测相关系数(Rp)、交叉验证均方差(RMSECV)、交叉验证相关系数(Rcv)、模型的性能指数等建模参数来评价所见模型的效果,不同定量分析模型的建模参数见表1。

表1 不同定量分析模型的建模参数Tab．1 Modeling parameters of different quantitative analysis models

通过分析表1中4种模型的内部验证、交叉验证得到的建模参数,可得出模型2为4种模型中的最优模型。所建模型2中样本预测值与真实值的关系见图2。由图2可知:建模值与内部验证值相互重叠,且真实值和预测值几乎相等。

2．4 模型的外部验证

将未参与建模的15个样本的近红外谱图,分别导入模型1、模型2、模型3、模型4 中进行外部验证,分别得到样本中尼莫地平含量的预测值,计算模型预测值及与HPLC 测定值的相对误差,结果见表2。

图2 样本中尼莫地平的预测值与真实值(模型2)Fig．2 Predicted and true values of nimodipine in samples(model 2)

表2 不同模型预测值和HPLC测定值的比较Tab．2 Comparison of predicted values by different models and determined values by HPLC

由表2可知:模型1尼莫地平的预测值与实测值的相对误差为－2．41%～2．68%;模型2尼莫地平的预测值与实测值的相对误差为－0．81%～1．18%;模型3尼莫地平的预测值与实测值的相对误差为－5．03%～4．55%;模型4尼莫地平的预测值与实测值的相对误差为－5．99%～5．56%。在95%的置信区间内进行t检验,4种模型对尼莫地平片中尼莫地平的预测值与HPLC 测定值无显著差异,故这4种模型均可用于尼莫地平的快速检测。

模型2用于实际药品的检测时,其预测值的准确性最高;模型1预测值的准确性仅次于模型2的;模型3和模型4预测值的准确性相对较差,且两者预测值的准确性相近。这是因为模型2采集的是药粉的近红外漫反射光谱,药粉颗粒细小、粉末均匀,不仅消除了药片大小、形状、样品在积分球样品杯中的堆积紧密程度等对测定结果的影响;还消除了药片中成分分布不均匀对测定结果的影响,所以模型2的预测效果最佳。

从建模参数考察模型2效果最好,从预测的准确性看也是模型2最佳。但采用模型2检测,需将样品粉碎成粉末,耗时相对较长,因此对既有素片、又有糖衣的成分分布不均匀的样品和形状各异的样品的检测建议采用模型2。而模型1无需对待测药品进行任何前处理即可达到快速准确分析的目的,可作为常规的检测方法。模型3和模型4预测的准确性稍差,但也无需对待测药品进行任何的前处理,且可一次性对同一样品进行两种类型的检测,可用作测定结果相互对照的试验。