应用刺探电位图谱（EPG）技术分析棉蚜取食刺探主动性

李玲玉，张帅，姬继超，雒珺瑜，崔金杰

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

棉 蚜 （Aphis gossypiiGlover） 属 于 半 翅目（Hemiptera）蚜科（Aphididae），是一种世界性棉花害虫，其主要通过吸食汁液、分泌蜜露和传播病毒等方式危害棉花[1]。 目前，对于棉蚜的研究，不仅集中在生活史[2]、发生动态[3]以及综合防治[4]等方面，而且关注新研究热点——棉蚜个体的取食行为[5]、寄主选择[6]以及传毒机制[7]等。 近年来，刺探电位图谱（Electrical penetration graph，EPG）技术在刺吸式口器昆虫取食行为的研究中起到了越来越重要的作用，应用该技术对昆虫取食行为的研究日益深入。

EPG 技术是记录刺吸式口器昆虫口针在叶片组织内外行为轨迹的一种电生理学技术。利用该技术可准确地记录昆虫口针在寄主植物组织内的动作和位置[8]。 这项技术最早是由美国加利福尼亚大学的McLean 和Kinsey 发明并用于检测蚜虫口针在植物组织内的取食活动， 后被广泛应用于多种刺吸式口器昆虫取食行为的研究[9-11]。目前，应用该技术研究棉蚜长时间取食行为的报道甚多， 但未见应用该技术对棉蚜刺探主动性研究方面的报道。

本研究通过EPG 技术，在室内条件下，测定不同时间中棉蚜刺探棉花叶片的主动性程度，对刺探时期和非刺探时期的EPG 参数进行统计和分析，初步探索了棉蚜刺探棉叶、吸食汁液的主动性在不同时间的差异，可为棉蚜取食行为的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

棉蚜于2019 年7 月采自中国农业科学院棉花研究所东场棉田（河南省安阳县），并于人工智能光照培养箱内饲养繁殖多代（n＞20）后用于试验。 培养箱的条件：温度（25±1）℃，光周期 L∶D＝14∶10，相对湿度（RH）＝70%～80%。

1.2 供试棉花品种

本试验使用的棉花品种为中棉所49， 由国家棉花种质资源中期库提供。

1.3 试验方法

1.3.1仪器设备。试验所用刺吸电位仪为八通道直流型（型号 DC-EPG Giga-8，荷兰Wageningen University），使用的铜钉、铜丝、金丝（直径 10 μm）均为该仪器配备。 信号转换器为DI-720 型（美国Dataq instruments，Inc）， 自制法拉第金属屏蔽罩 80 cm×60 cm×60 cm，网孔孔径 0.250 mm（60 目）。记录软件为EPG style＋d 软件。

1.3.2棉蚜刺吸电位试验方法。将30 头成蚜接到独立罩笼的中棉所49 棉花叶片上，当其产仔时，移去成蚜，保留仔蚜继续饲养，待到仔蚜成虫后，选择真叶3 叶期棉苗用于试验。

1.3.3EPG 记录与波形分析。试验在室内条件下进行，室温25 ℃左右，整个EPG 系统置于法拉第金属屏蔽罩中以防止外界噪音影响记录。 试验前，对EPG 系统进行校准。 按照胡想顺等[10]方法将长度约3 cm 的金丝用导电银胶粘连到棉蚜成虫的前胸背板上。 棉蚜在粘连金丝之后，对其进行1 h 的饥饿处理，之后将昆虫电极连入EPG 装置，植物电极则插在棉苗生长的土壤中。调整棉蚜在棉花叶片背面上的位置，使其有一定的活动范围。 根据田间施药习惯，推测棉蚜在08∶00―12∶00 和15∶00―19∶00 较为活跃， 故选择具有代表性的8 个时段（每日的 08∶00―12∶00 和 15∶00―19∶00，以1 h 为1 个时段）进行试验，每整点开始记录，记录时间为1 h，每头棉蚜只使用1 次，每个处理取得有效重复8 次。

当棉蚜口针刺入棉花组织时，回路接通，电流经转换器转换为数字信号，再由style＋d 软件转化成波形图谱，记录并保存。 根据胡想顺等对蚜虫取食行为波形的划分，可将棉蚜在棉花上的取食波形分为2 类。第一类：非刺探时期（棉蚜口针未刺入叶片组织的阶段）波形（Np 波）；第二类：刺探时期波形，包括蚜虫口针在叶肉细胞间隙或韧皮部筛分子外部刺探 （C 波）， 蚜虫口针在生活细胞内部刺探（Pd 波）， 蚜虫口针在植物组织和细胞外部遇到机械阻力（F 波），蚜虫口针在韧皮部筛分子内分泌唾液（E1 波），蚜虫口针在韧皮部筛分子内部被动取食（E2 波）[10]。

1.4 数据处理

用软件style＋a 对波形进行分析， 将各EPG参数分类统计后， 运用SPSS22.0 软件对棉蚜在不同时间上的各EPG 参数分别进行分析。 因各参数之间互不干扰，相互独立，所以本研究采用3 种分析方法。 Np 波、C 波和Pd 波的所有参数，以及第1次E1 波出现时间、E2 波出现时间， 数据符合正态分布规律，故采用单因素方差分析（事后比较采用最小显著差数（LSD）和邓肯氏（Duncan's）法）；F 波参数以及其余E1 波、E2 波参数， 数据不符合正态分布规律， 故采用非参数检验 （Kruskal-Wallis 检验）。 并以“刺探波形总时间”为指标进行系统聚类分析（组间联接法）。

2 结果与分析

2.1 棉蚜口针在韧皮部之外的刺探行为

棉蚜口针在韧皮部之外刺探行为对应的EPG参数见表1。

Np 波总次数在08∶00―10∶00 显著低于除16∶00―17∶00 外的其他时段（P＜0.05）；08∶00―10∶00 和 16∶00―18∶00 的 Np 波总时间最短，以及 08∶00―11∶00 和 16∶00―19∶00 的 Np波平均持续时间较短，与其他时段的差异均达显著水平（P＜0.05）。

C 波出现的早晚反映棉蚜对叶肉细胞间隙刺探的主动性程度。 在 08∶00―10∶00 和 16∶00―18∶00，C 波出现的时间显著早于其他时段 （P＜0.05）。 其中在 08∶00―9∶00 和 16∶00―17∶00时段的C 波显示，接通电源后26 s 左右，棉蚜开始刺探棉花叶片。 C 波总次数在16∶00―17∶00 显著高于其他时段，C 波总时间在08∶00―10∶00和16∶00―18∶00 显著高于其他时段；而在 15∶00―16∶00，C 波总时间和总次数均达到最低， 并与其他时段差异显著（P＜0.05）。 C 波平均持续时间在08∶00―09∶00 最长， 在 09∶00―11∶00 和17∶00―18∶00 次之，在 11∶00―12∶00、15∶00―17∶00 和 18∶00―19∶00 较短。

Pd 波最早在 08∶00―10∶00 和 16∶00―18 ∶00 出 现 ，10 ∶00 ― 11 ∶00 次 之 ， 最 晚 在11 ∶00―12∶00、15∶00―16∶00 和 18∶00―19∶00 出现；Pd 波总时间在 08∶00―10∶00 和16∶00―19∶00 较高， 在 15∶00―16∶00 最短；Pd 波总次数在 09∶00―10∶00 和 16∶00－17∶00较高，在 15∶00―16∶00 最低；而 Pd 波平均持续时间在 09∶00―10∶00 和 16∶00―17∶00 较低。

F 波在 08∶00―10∶00、11∶00―12∶00 和16∶00―17∶00 没有出现。F 波总时间和平均持续时间在 15∶00―16∶00 最长，在 17∶00―19∶00次之，在10∶00―11∶00 最短，但差异均未达到显著水平（P＞0.05）。 F 波总次数和有 F 波的个体数在 10∶00―11∶00 和 15∶00―16∶00 较高。

2.2 棉蚜口针在韧皮部取食的刺探行为

棉蚜口针在韧皮部之内刺探、分泌唾液和吸食汁液行为对应的EPG 参数见表2。

E1 波在 08∶00―10∶00 和 16∶00―17∶00较早出现，而在 15∶00―16∶00 和 18∶00―19∶00出现最晚；E1 波总次数在各时段均无显著差异（P＞0.05）； 在 11∶00―12∶00，E1 波总时间和平均持续时间略高于其他时段，但差异未达到显著水平；各个时段有E1 波的个体数差异不大。

00 19∶0－0 18∶0 0 18∶00－7∶1 a 7 4.5 2.50±1 ab 4.81 0±11.5 b 9 33.7 4 2.02±10 1 c 6 90.3 1 8.35±61 c 9.04 1 6.85±8 cd 6.79 1 9.65±5 b 8 5.7 9.82±5 c 4.51 1±40.8 de 1 7.2 2.50±5 cd 5.63 0±55.0 c 6 06.8 2 0.14±09 2 b 7.60 7 4.74±56 2 bc 9 4.3 0.21±4 ab 4.16 9±46.9 a 0.46 3 2.43±39 c 3 25.3 6±80.8 2 c b 1.77 3 8.38±10 c b 8.89 2 6.00±10 ab 6.64 6 9.48±19 ab 4.72 5 5.15±19 ab 6 0.1 1.82±ab 0.23 5±1.8 a 0.35 5±0.12 a 5 0.3 25±0.1 a 2 54.1 2 9.84±8 a 5 70.5 2 5.65±9 a 2 54.1 2 9.84±8 a 5 70.5 2 5.65±9 3 0.1 3 0.1数参G P E的时部皮韧达到次1第到始开探刺从中段时个8在蚜棉1表段时数参G P E 00 17∶0－0 16∶0 0 16∶0－0 5∶1 00 2∶1 00－1∶1 00 11∶0－0 10∶0 0 0∶1 00－9∶0 00 09∶0－0 08∶bc 2 3.1 8.00±ab 7 4.1 0±10.5 ab 1.81 1.13±1 a 1 3.5 0±13.5 c 2.93 6.00±c 6 0.7 0±5.0数次总波p N c 2 15.5 1 363.13±a 442.897.95±73 1 a 1 25.4 3 5.32±49 1 b 0 34.8 2 949.71±c 155.509.35±35c 4 13.9 1 5.43±36/s间时总波p N d 2.99 1 47.28±a 38.03 6±77.1 1 b 8.02 2 4.78±13 cd 16.18 1±71.5 cd 2 11.3 2.78±6 cd 5.50 1 2.02±7/s间时续持均平波p N e 6 4.9 23.83±a 3 7.2 6±69.8 ab 0.90 1 2.74±6 b 2 7.5 8±60.1 d 5.53 2.96±3 de 6 9.0 1±28.7/s间时现出波C次1第a 9 4.2 72.13±f 10.08 5±29.7 e 3.98 5.88±4 de 7 5.9 5±51.7 b 5.24 4.00±6 bc 2 6.3 8±60.3数次总波C a 6 61.0 1 922.81±2 e 424.392.87±05 1 d 1 22.8 1 6.29±71 1 c 1.18 11 5±79.0 2 2 a 184.598.97±94 2 a 157.416.09±96 2/s间时总波C bc 5 3.3 40.65±c 12.43 4±35.5 c 3.47 7.60±3 ab 2 6.7 9±44.6 ab 3.51 6.26±4 a 8 4.9 2±49.5/s间时续持均平波C c 6.88 2 250.63±a 29.37 1±63.1 3 a 1.87 2 1.65±38 b 32.55 3±30.1 3 c 6 27.4 8.22±27c 22.31 2±49.8 2/s间时现出波d P次1第a 1.99 2 155.25±d 19.40 3±44.6 cd 4.55 2 6.50±7 cd 41.47 5±72.7 ab 7 34.9 8.88±13bc 0.14 4 6.50±10数次总波d P a 5.07 4 252.56±c 52.11 4±14.8 1 bc 4.61 3 2.79±15 c b 63.39 8±68.1 1 ab 9 50.1 6.40±21ab 2.37 6 1.25±21/s间时总波d P b 3 0.1 1.62±ab 9 0.1 5±2.5 ab 0.20 2.04±a 1 6.7 9±4.3 b 0.07 1.57±ab 6 0.3 9±2.0/s间时续持均平波d P―a 6 0.4 5±0.2―a 6 0.4 5±0.2――数次s）总10于（大波F―a 0.0266 5±47.4 3―a 1.6110 0±54.5――/s间时）总s 10于（大波F―a 0.0266 5±47.4 3―a 1.6110 0±54.5――/s 间时续持均s）平10于（大波F―0.25―0.25――数体个）的s 0 1于（大波F有。）5 0.0（P＜著显异差示表母字写小同不后字数行一同；据数形波的应对无段间时该示表”―“，差准标±值均平为据数：注

0 0 19∶00－8∶1 0 0 18∶00－7∶1 a 18.47 1 9±984.9 2 bc 0 19.8 2 1.44±45 2 a 3 2.3 0±2.5 a 1.77 3.00±a 5.50 5 9±64.3a 9.93 3 0.07±7 a 4.27 1 9±16.7a 8.88 0.81±2 0.630.88b 9.84 2 8±444.7 3 b 2.37 5 2.75±42 3 a 1 0.7 5±0.7 a 0.74 0.63±a 4 9.1 3±7.5 a 5.44 1 2.50±1 a 6 5.7 7±5.8 a 0.59 1 9.83±0.630.50a 1.13 6 2±71.9a 3.15 4 2.56±8 a 7 0.4 6±0.5 a 0.33 0.74±a 8 0.0 7±0.0 a 0.15 0.14±数参G P E的时束结录记到部皮韧达到次1第从中段时个8在蚜棉2表段时数参G P E 0 0 17∶00－6∶1 0 0 16∶00－5∶1 0 0 12∶00－1∶1 0 0 11∶00－0∶1 0 0 10∶00－9∶0 0 0 09∶00－8∶0 d 3.34 13 1±49.6 1 2 a 9.0021 2±97.5 0 3 b 93.53 8±07.5 6 2 bc 7 39.0 1 7.96±40 2 cd 1 69.3 1 5.21±28 2 cd 6 05.8 2 4.58±26 2/s间时现出波1 E次1第a 0.64 3±1.1 a 1 3.0 5±2.7 a 9 1.4 5±2.2 a 2.64 3.13±a 0 1.6 1.63±a 0 1.2 1.00±数次总波1 E a 1 17.5 7±29.1 a 57.60 2±64.3 a 2.1113 9±02.2 2 a 2.58 5 0.24±6 a 0.94 4 2.52±4 a 7.85 2 4.14±2/s间时总波1 E a 9.56 8±22.5 a 14.31 2±16.2 a 45.80 8±69.1 a 0.10 1 2.00±1 a 4.55 1 7.00±1 a 4.72 1 2.90±1/s间时续持均平波1 E 0.880.630.750.630.63 0.50数体个的波1 E有c 8 61.3 2±48.2 1 3 a 36.82 6±93.2 5 3 a 66.67 9±16.4 5 3 b 8 25.7 1 9.16±36 3 c 9 02.8 1 7.18±24 3 c 3 06.7 1 7.27±18 3/s间时现出波2 E次1第a 0.35 3±0.1 a 1 0.7 5±0.2 a 3 2.4 5±1.2 a 1.07 1.00±a 9 1.3 0.75±a 4 1.6 0.88±数次总波2 E a 3.41 1±1.2 a 8 1.3 9±0.4 a 34.40 9±16.5 a 4.64 1 3.25±1 a 1.95 2 2.00±1 a 2.31 2 1.92±1/s间时总波2 E a 3.41 1±1.2 a 9 0.6 4±0.2 a 2 6.3 2±4.5 a 7.32 6.63±a 1 8.4 6.08±a 2 6.3 3.41±/s间时续持均平波2 E 0.130.130.380.500.38 0.25数体个的波2 E有a 5 20.0 7±30.3 a 57.84 1±64.8 a 0.9214 7±18.8 2 a 4.09 6 3.49±7 a 2.03 5 4.52±5 a 6.39 4 6.05±3/s间时总）波2 E+（E1 E a 0.35 6±0.8 a 1 0.5 2±0.6 a 4 0.4 0±0.7 a 0.44 0.52±a 6 0.4 0.51±a 5 0.4 0.38±波E个整占间时总1 波E例比的间时a 0.05 2±0.0 a 2 0.0 1±0.0 a 1 0.1 5±0.0 a 0.12 0.11±a 9 0.1 0.11±a 2 0.2 0.12±波E个整占间时总波2 E例比的间时。）0.05（P＜著显异差示表母字写小同不后字数行一同；差准标±值均平为据数：注

E2 波最早在 08∶00―10∶00 和 16∶00―17∶00 出现，10∶00―11∶00 和 17∶00―19∶00次之，在 11∶00―12∶00 和 15∶00―16∶00 出现最晚；在 15∶00―17∶00，E2 波总次数、总时间、平均持续时间和有E2 波的个体数均低于其他时间段，但差异未达到显著水平（P＞0.05），在其他时间段 E2 波总次数、 总时间等参数差异不大。 在11∶00―12∶00，E 波总时间略高于其他时间段，但所有时段之间均无显著差异（P＞0.05）；在整个E 波总时间中，E1 波时间占比高，E2 波时间占比低，且在各个时段之间差异不显著。

2.3 不同时段中棉蚜刺探波形与非刺探波形时间的比较及聚类分析

图1 棉蚜在不同时段中刺探波形和非刺探波形时间占相应时段总时间的百分比

通过比较棉蚜在不同时段刺探波形 （C 波、Pd波、F 波和 E 波）和非刺探波形（Np 波）时间占相应时段总时间（简称“总时间”）的百分比（图1）发现，在各个时段中， 各种EPG 波形时间占总时间的比例存在较大差异。C 波和Np 波为优势波形，2 个波形的时间和占总时间的80%以上。 Np 波时间在08∶00―10∶00 和 16∶00―18∶00 中的比例较其他时间段少，且在08∶00―10∶00 和 16∶00―17∶00 中的比例相差极小； 而在15∶00―16∶00中最高， 占波形总时间的50%以上。 C 波时间在08∶00―10∶00 和 16∶00―17∶00 所占比例较高，均超过 80%；而在 11∶00―12∶00 和 15∶00―16∶00 中， 所占比例较低， 均低于波形总时间的50%。 Pd 波时间所占比例在各个时段中差异不大，在 16∶00―17∶00 略高于其他时段，在 15∶00―16∶00 所占比例最低。F 波时间在 15∶00―16∶00中所占比例最高，占总时间的10%以上，在其他3个时段差异不大。 E 波时间在11∶00―12∶00 中所占比例较高，在其他时段差异不大。

采用最长距离法以棉蚜在不同时段中4 种刺探波形（C 波、Pd 波、F 波和 E 波）的时间为指标进行聚类分析， 可以把试验的8 个时段大致分为3类：第Ⅰ类为 08∶00―09∶00、09∶00―10∶00、16∶00―17∶00 和 17∶00―18∶00， 第Ⅱ类为10∶00―11∶00、11∶00―12∶00 和 18∶00―19∶00，第Ⅲ类为 15∶00―16∶00（图2）。 对以上3 类时段中的4 种刺探波形时间进行方差分析发现，其均存在显著差异（P＜0.05）：C 波和 Pd 波时间在第Ⅰ类中显著高于其他2 类，在第Ⅲ类中这2种波形时间最短；F 波和E 波时间在3 类分组之间无显著差异。以上结果说明棉蚜在这3 类时间段上的刺探行为的主动性存在差异（表3）。

图2 棉蚜在8 个时间段刺探行为的聚类分析结果

表3 3 类时段中4 种刺探波形的时间比较 s

3 讨论

刺吸式昆虫的刺探过程从口针接触植物表面开始，穿刺表皮至韧皮部的多层细胞，最终到达韧皮部吸食植物汁液。 EPG 技术作为一种研究刺吸式昆虫取食行为的电生理技术，具有试验周期短、试验环境可控、操作简便等优点，可以在室内条件下，根据输出波形的不同，分析昆虫生理活动的差异[10,12]。

本研究分析了棉蚜在一天8 个不同时段中刺探主动性的差异，结果表明：棉蚜在试验阶段中，均表现出了尝试刺探的意愿；并且在08∶00―10∶00和16∶00―18∶00，棉蚜尝试刺探意愿强烈，短暂爬行、停息或寻食，口针频繁在叶肉细胞间隙和叶肉细胞中刺探，多次在韧皮部筛管细胞中分泌唾液和被动吸食。 以上EPG 现象均反映出棉蚜在这段时间中，刺探主动性强、刺探次数多和取食叶片汁液频繁等特点。产生此现象的原因可能有：（1）环境因素。 在这段时间中，环境温度和光照强度均处于适宜的范围，有利于棉蚜的刺探和吸食。（2）昆虫因素。在长期进化过程中，昆虫产生了一定的节律性，能够调节本身的行为和生理变化，使其与外部环境变化相适应。（3）植物因素。植物在不同时间产生的挥发性物质种类和浓度，以及对昆虫的吸引力的不同，可能也是产生上述现象的原因之一。

对不同时段中棉蚜各种EPG 波形时间的比较及聚类分析结果显示，棉蚜在叶片表面爬行、寻找刺探位点和在叶肉细胞间隙中刺探的时间较多，占整个取食过程时间的80%以上，甚至超过90%，且在各个时段之间的差异非常明显。棉蚜口针位于叶肉细胞间隙和细胞内的刺探时间在08∶00―10∶00和16∶00―18∶00 的比例最高， 且大幅高于其他时段，说明在这段时间中，棉蚜口针在细胞内和间隙中移动， 持续寻找合适取食部位。 棉蚜口针在15∶00―16∶00 遇到较强的机械阻力， 这可能与棉花自身的防御反应和自身的植物节律密切相关，产生这种现象的具体原因目前尚不清楚。 棉蚜在10∶00―12∶00 和 18∶00―19∶00， 在韧皮部分泌唾液、被动吸食汁液的时间较长，说明在这段时间中，棉蚜对于韧皮部汁液喜好程度高。 这可能与环境温度和光照强度有关， 因为环境温度的升降、光照强度的强弱，都有可能刺激棉蚜口针在植物韧皮部停留。 以上结果显示，棉蚜在8 个不同时段的取食、刺探行为的变化，初步反映棉蚜在时间上存在不同的刺探主动性，可为棉蚜取食行为的研究提供参考和新思路，丰富EPG 技术应用方面的内容。

4 结论

利用刺吸电位仪记录棉蚜在一天中8 个不同时段的取食、刺探行为，比较分析结果显示，在试验条件下，08∶00―10∶00 和 16∶00―18∶00，棉蚜刺探主动性强、刺探次数多且时间长、取食叶片汁液频繁。 这些结果可为棉蚜取食行为的进一步研究提供参考。