血清25-羟维生素D-3及谷氨酸脱氢酶在肝细胞癌中的表达及意义

韩瑜

(济源市人民医院肿瘤科，河南 济源459000)

肝细胞癌 （Hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌的70%~80%，是肝硬化患者死亡的主要原因,5年生存率不到10%,是威胁人类健康的恶性肿瘤之一,但其早期发现、早期诊断和早期治疗，可使其5年生存率达70%左右，故对HCC的早期诊治尤为重要[1]。 尽管近年来,甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白异质体（AFP-L3）和异常凝血酶原（DCP）三联检、腹部B超、CT等技术手段明显提高了HCC的早期诊断率[2,3]，但对HCC的诊断和预后判断仍存在误诊和漏诊等局限性。有研究表明谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）水平在肝癌患者中升高,升高程度与肝损伤程度呈正相关[4]。但关于血清25-羟维生素D-3（25(OH)D3）在HCC早期诊断和预后判断中的研究报道甚少。故本研究通过检测25(OH)D3和GLDH在HCC患者中水平的变化以及其与HCC临床分期的关系,分析二者对HCC的诊断价值，探讨二者在HCC患者中的相关性，以期为HCC的早期诊断和病情评估以及寻找新的治疗靶点提供一定的理论依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择80例2015年6月-2017年6月在本院经组织病理学确诊为初诊HCC患者为观察组，其中男性45例，女性35例，年龄45～75岁，平均年龄（61.35±11.48）岁。所有患者均经过手术病理组织学确诊且术前未接受过化疗、放疗治疗。遵循美国癌症联合委员会（AJCC）制定的第八版肝细胞癌TNM分期标准[5],观察组中Ⅰ期患者21例、Ⅱ期患者18例、Ⅲ期患者26例及Ⅳ期患者15例。另选择80例本院健康体检者作为对照组，其中男性42例，女性38例，年龄44～75岁，平均年龄（62.27±12.86）岁。两组对象的年龄、性别等数据比较无统计学意义（P＞0.05），具备可比性。所有观察对象均签署知情同意书以及本实验获得医院伦理委员会的批准。

1.2 纳入与排除标准 观察组纳入标准：⑴所有患者均为初诊并经病理组织学确诊;⑵所有患者术前均未进行药物、化疗和（或）放疗等治疗；⑶所有患者的临床病历资料完整。排除标准：⑴患有胆囊癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌等其他恶性肿瘤和其他肿瘤并发肝脏转移者；⑵心、肺、肝、肾功能、血脂、血糖异常者；⑶患有自身免疫性疾病者、甲状腺疾病和妊娠者；⑷病理资料和病历资料不完善者。

1.3 研究方法 所有观察对象于空腹时采集静脉血5ml，3000r/min离心10min后收集上清,存放于-80℃冰箱以便检测。25(OH)D3检测采用ELISA法，检测试剂购于中国武汉博士德生物工程有限公司,检测仪器采用THERMO Multiskan FC全自动酶标仪。GLDH检测采用酶学速率法，检测仪器采用美国贝克曼AU 5800全自动生化仪,检测试剂购于德国德赛诊断系统有限公司。所有检测项目严格按照说明书进行。比较两组对象血清25(OH)D3和GLDH水平差异以及不同TNM分期HCC患者血清中25(OH)D3和GLDH的水平差异。

1.4 统计学处理 数据由SPSS19.0软件处理。计量资料采用(x±s)表示，两组间的差异比较采取t检验，多组间比较采取单因素方差分析。ROC曲线分析25(OH)D3和GLDH对HCC的诊断价值。采用Pearson法进行HCC患者血清25(OH)D3及GLDH水平间的关联分析。P＜0.05为比较差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清25(OH)D3和GLDH的水平比较 与对照组比较，观察组血清25(OH)D3水平明显降低，血清GLDH水平明显增高，且差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 观察组和对照组血清25(OH)D3、GLDH的水平比较(x±s)

2.2 不同分期HCC患者血清25(OH)D3和GLDH的水平比较 单因素方差分析结果显示：HCC分期越高，患者血清25(OH)D3水平越低，而血清GLDH水平越高，数据具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同分期HCC患者血清25(OH)D3和GLDH的水平比较(x±s)

2.3 血清中25(OH)D3和GLDH对HCC的诊断价值 ROC曲线分析结果显示：25(OH)D3和GLDH对HCC的诊断AUC面积分别是0.814和0.806，诊断敏感性分别为81.30%和83.80%，诊断特异度分别为78.12%和80.53%,因AUC面积在0.7～0.9时具备一定准确性,因此,血清中25(OH)D3和GLD H的水平对HCC具备一定的诊断价值，见表3及图1。

表3 血清中25(OH)D3和GLDH对HCC患者的诊断价值

图1 血清中25(OH)D3、GLDH对HCC患者的诊断价值

2.4 HCC患者血清25(OH)D3和GLDH水平的相关性分析 Pearson直线相关性分析结果显示：HCC患者血清25(OH)D3和GLDH水平呈负相关（r=-0.457，P<0.05），见图 2。

图2 HCC患者血清25(OH)D3和GLDH水平的相关性分析

3 讨论

根据癌症流行病学报道，2015年中国新诊断的肝癌患者46万余,因肝癌而死亡的病理42万余例，而HCC是最常见的肝癌类型，其危险因素包括酒精、HBV或HCV所致肝炎、肥胖、黄曲霉素感染等[6]。HCC的血管浸润程度高、转移及复发潜能大，即使目前HCC的诊断和治疗技术已大大改进，但其早期诊断率及治疗效果仍需要进一步完善[7]，故筛选出新的HCC生物标记物对预测HCC的发生发展及分子靶向治疗十分必要。

GLDH是一种含Zn2+的金属结合酶，有400~500个氨基酸，广泛分布于肝、肾、心脏及骨骼肌等，肝细胞中含量最高，脑和肾的含量次之，活性位点主要是赖氨酸残基,活性不易受到个体或者季节等因素影响[8]。GLDH 以 NAD(H)和 NADP(H)为辅酶,催化L-谷氨酸及α-酮戊二酸的可逆反应,参与的生物过程包括三羧酸循环、能量的产生、信号传导等，在肌内内环境稳态、氨基酸转化、碳水化合物的代谢等过程中意义重大[9]。GLDH在肝内主要集中与线粒体基质内,活性增高时常常预示肝小叶的中央区细胞坏死，反映肝实质细胞的坏死，是肝脏较为灵敏、特异的指标。GLDH异常激活时能够促进肿瘤细胞（如胶质瘤、结直肠癌等）的增殖、抗凋亡效应及免疫逃逸等，进而促进肿瘤的发生发展[10]。本结果发现HCC患者血清GLDH水平表达增加，其高低与患者TNM分期有关，分期越高，TNM分期的表达量越丰富。这与易婷婷等[4]人的研究结果一致，我们猜测其原因可能与氧化应激障碍以及能量异常代谢有关，其涉及的具体机制可能与人去乙酰化酶4(SIRT4)、雷帕霉素靶蛋白复合体 1(mTOR1)和转录活化因子-3（STAT3）等致癌基因的过度激活导致肿瘤细胞的增殖、侵袭和血管形成有关[11]。

25(OH)D3在体内由维生素D转换而成，是体内维生素D的最强活性形式，存在形式稳定，生物学作用主要包括调控体内的钙磷平衡、血糖水平、稳定内环境及调节细胞的增殖、分化[12,13]。有研究指出25(OH)D3可通过促进细胞分化、诱导细胞的凋亡等方式调控肿瘤细胞的周期、激活巨噬细胞释放TNF-α以及调节微环境，降低肿瘤细胞胶原酶以及黏连蛋白受体表达等方式发挥广泛杀伤的抗肿瘤效应，抑制肿瘤的侵袭及转移，进而抑制肿瘤的进展[14-16]。本文结果发现HCC患者血清25(OH)D 3水平表达明显减低，且这种减低与HCC患者的TNM分期有关，分期越高，血清25(OH)D3水平表达越低。我们推测这种变化与25(OH)D3可通过上调张力蛋白同源物磷酸脂酶基因（PTEN）蛋白的表达，抑制PI3K/AKT信号传导通路，下调增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达有关[17]。

ROC曲线分析结果显示25(OH)D3和GLDH对HCC的诊断AUC面积分别是0.814和0.806，且诊断敏感性和特异性均较高,说明血清25(OH)D3和GLDH对HCC具备一定的诊断价值,这为HCC的诊断提供了新的实验室指标,具有一定的临床应用价值。Person相关性分析结果显示血清25(OH)D3和GLDH水平在HCC患者中的表达呈负相关性，这表明二者之间存在分子机制相关性，具体有待于进一步的探讨研究,这可能可作为HCC的联合诊断指标及分子治疗的靶点。

综上所述，HCC患者中血清GLDH水平表达升高，25(OH)D3表达水平减低，二者水平表达的高低与临床病理分期关系密切，且二者均对HCC具有一定的诊断价值以及在HCC患者中的表达呈负相关性，表明血清25(OH)D3和GLDH与HCC的发生发展存在紧密联系，对疾病的诊断、分子靶向治疗及预后的判断具有重要意义。