AR-V7的检测技术及其在去势抵抗性前列腺癌诊断中的研究进展

尹冶，段秋婷，周晋宇，陈振杰，辉红蕾综述；王玉明审校

（昆明医科大学第二附属医院1.检验科；2.泌尿外科，云南 昆明 650000）

截止2019年,美国确诊的PCa病例数超过174,650例，约31,620人死于该病[1]。我国男性PCa发病率与死亡率均呈快速上升的趋势,据国家癌症登记中心统计，截止2015年，该病患病人数超过6万，死亡率达1/3，而这些数据仅仅覆盖了全国人口的6.5%[2]，情况不容乐观。该病早期症状不明显，多数患者就诊时常已是晚期,雄激素剥夺疗法(Androgen deprivation therapy,ADT)是晚期PCa的主要治疗方案，然而，绝大多数患者在经过一定的缓解期后开始抵抗内分泌治疗,最终发展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC),并常伴器官转移，预后较差，死亡率高[3]。前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）是临床公认的PCa标记物，有较高的组织特异性，但PSA的水平受前列腺癌分化程度和转移情况的影响，且在良性和恶性前列腺疾病中均升高，一定数值范围内不具肿瘤特异性[4]。研究表明[5-8]，雄激素受体（androgen receptor，AR）信号通路再激活是CRPC发生、发展和耐药的重要作用机制，AR-V7在CRPC患者中高表达并与PSA浓度正相关，是激活这一通路的关键所在，也是CRPC最具潜力的标记物。但目前AR-V7的检测技术要求严格且难以推广,临床研究中一直缺乏大量的前瞻性数据对ARV7作为CRPC的新标记物进行可靠的验证。可喜的是，近年来AR-V7的检测手段取得了一系列的新突破，为推进AR-V7在临床常规中的应用提供重要的技术支持。

1 AR-V7的结构

AR是核受体超家族中的一种类固醇类反转录调节蛋白,其基因位于Xq11-12，有八个外显子和七个内含子，可编码919个氨基酸。全长型雄激素受体（full-length androgen receptor,AR-FL）包括氨基末端域 (N-terminal domain,NTD)、DNA结合域（DNA-binding domain,DBD）、铰链区和羧基末端配体结合域 (ligand-binding domain,LBD)见图1。AR基因剪切重组后mRNA的翻译停止在第16位氨基酸，形成缺乏LBD域的截短型AR受体，称为雄激素受体剪切变异体（androgen receptor splice variants,AR-Vs），AR-V7 在 20 多种 AR-Vs中含量最多最具代表性,可检测其同源编码蛋白[9]。ARV7具有完整的NTD域、DBD域以及一个特殊的C端。NTD结合转录共调节因子后形成AF-1，并通过配体非依赖途径活化,在无雄激素结合时仍然激活靶基因的转录；DBD内含两个α螺旋型锌指结构，参与特异碱基序列的识别，并促进雄激素反应元件同AR的结合；C端延伸结构域的作用目前研究较少。

图1 全长雄激素受体（AR-FL）和剪切变异体7（AR-V7）转录物结构

2 AR-V7检测方法的新进展

对于CRPC中AR-V7的检测，富集循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）提取 RNA 进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是目前最常用的方法。迄今为止，美国临床上有两种常用的基于CTC的检测试剂[10]：Qiagen公司2018年在美国癌症协会年会上推出的Adna Test Prostate Cancer Panel AR-V7 Kit试剂盒,用PCR检测被捕获的CTC中AR-V7的水平；另一种是最近推出的将免疫荧光应用于CTC中AR-V7蛋白质的分析。常规活检组织的检测则以RNA原位杂交（RISH）、荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学染色（IHC）、转录组测序技术（RNA-Seq）和蛋白印迹等为主。近年来，全血和尿液标本中的AR-V7检测引起了研究人员的注意，大量研究开始着力于完善和优化常规检测手段并开发无创、简便和高效的技术。

2.1 活检组织中AR-V7的检测 目前,前列腺穿刺活检仍然是诊断PCa的金标准,新鲜活检组织常直接冷冻或用福尔马林固定后制成石蜡包埋切片（FFPE）。常规AR-V7原位检测以AR基因内含子3内的隐蔽外显3b（CE3b）为靶位，使用集成的探针设计和信号放大策略将目标信号放大数千倍，虽然与传统的原位检测相比，信噪比得以降低，但需要多个平铺探针覆盖1kb以上的靶序列，且AR-FL同样具有CE3b序列，故AR-V7特异性剪切点的检测分辨率较低。对此，Yezi等[11]设计并优化了一种称为BaseScope的探针，开发出高度特异和可量化的新型RISH方法，该探针分别跨越AR外显子 3（E3）和 CE3b、外显子 7（E7）和外显子 8（E8），连接形成“双 Z”型的寡核苷酸序列（1-ZZ）并靶向覆盖单个剪切点,不同跨越点的剪切点可分别对AR-V7和AR-FL特异。应用这种新方法定量检测44名转移性CRPC患者活检组织中的AR-V7，若以0.4为RISH结果的cut-off值，则15名患者AR-V7阳性，且经LNCaP95细胞验证发现BaseScope探针的特异性优于常规探针。

原位检测与蛋白印迹、RNA-Seq等方法联合可提高AR-V7检测的特异性和灵敏度[12,13]。Djusberg等[14]通过分析FISH的PCR拷贝数来评估AR基因的扩增，用微阵列检测CRPC患者AR基因扩增时AR-V7mRNA的表达水平,并对高表达的标本进行IHC,最后用共聚焦显微镜进行蛋白定位的验证，结果显示核定位染色增加,证实了AR-V7存在于细胞核中。LiHeng等[15]用兔单克隆抗体对168例CRPC活检组织进行IHC,根据免疫反应评分（A R-V7阳性：>2）分析AR-V7的表达情况。该研究考虑到PCa的异质性，选择AR-V7表达最强的区域进行评估,并用靶向E1、E7和CE3b的siRNA转染LNCaP和22Rv1细胞作为阴性对照，以确保单克隆抗体与AR-V7的特异性结合。32例AR-V7阳性切片显示，AR-V7主要分散表达于恶性PCa的腔上皮细胞核中,且该类细胞占恶性腺体的15%-80%。另外，血管和基质细胞AR-V7为阴性，可考虑作为IHC的内部对照。兔单克隆抗体虽被普遍使用，但抗体常结合组织中的其他蛋白质，降低检测的特异性。因此，Sharp等[16]针对CE3b开发出重组兔单克隆抗体（RM7）,用western印迹验证抗体分子量，并通过免疫沉淀证实RM7与原有的ARV7抗体EPR15656相比，特异性和亲和力均增加，脱靶率降低。以RM7为优化抗体进行CRPC组织的IHC检测，133份FFPE标本中有34份AR-V7核染色阳性（核H评分＞10），其中41份转移性肿瘤标本的RNA-Seq转录分析表明407个基因与AR-V7高表达相关。

组织活检标本中AR-V7的检测经济简便、结果直观、灵敏度较高，但检测周期冗长、抗体特异性不足、难以长期保存。不可否认的是，即使量化标准不同，原位检测仍是活检组织检查的关键技术，开发更高效可行的检测手段将推进AR-V7在临床中的实际应用。

2.2 CTC中AR-V7的检测 相比侵入性组织活检,液体活检近几年有巨大的发展趋势。FDA将CTC定义为有核（DAPI+）、白细胞抗原阴性（CD45-）的上皮细胞（CK+），并批准CTC计数作为PCa的预后评价指标[17]。但人体外周血中CTC仅占白细胞的百万分之一，细胞富集是检测的关键。识别上皮源性标志物（如上皮细胞粘附分子和细胞角蛋白）的免疫细胞磁性富集法，借助铁磁流体、磁性微粒或纳米粒子等胶体分散体，加以磁场进行强磁化，铁磁流体中的磁性颗粒涂覆有针对上皮源性标志物的抗体。一旦系统捕获靶细胞，便用对上皮细胞特异的荧光抗体进行标记,从而对CTC进行计数等系列分析[18]。也有其他平台根据形态差异和电生理特征来捕获CTC。但在完成上皮-间充质转化过程中CTC的上皮细胞粘附分子减少或形态特征发生变化时，识别便无法进行。且以CTC计数≥5的标准来评估PCa患者的生存预后可信度低,临床获益小，而CTC中AR-V7的检测可提供计数外的诸多信息,关键在于如何在数十亿个血细胞中有效富集CTC以裂解进行qRT-PCR，且目前有关AR-V7转录物比例的定量信息较少。

半自动化CellSearch®系统是经过全面的临床试验后唯一获得FDA批准用于CTC计数的金标准，该系统的出现使CTC中AR-V7的相关研究得以深入开展[19,20]。Sharp等[21]用AdnaTest试剂盒测定181名CRPC患者CTC(由CellSearch计数)中的AR-V7，35%患者CTC+/AR-V7+,但尚无证据表明CTC中AR-V7阴性患者的生存率比阳性患者低,且无CTC计数的患者取癌组织经IHC亦可检测到AR-V7,这提示了有关CTC中AR-V7状态的预后研究必须考虑CTC计数以增加敏感度。应该提及的是,研究证明[22]qRT-PCR中SYBRGreenⅠ法和TaqMan探针法对CTC中AR-V7检测分析的性能具有高度的一致性，二者均可用于AR-V7的检测。目前，El-Heliebi等[23]新提出基于细胞水平的原位锁定探针技术较有优势,通过将体内可用的CTC富集装置（CellCollector）与细胞锁定技术相结合检测AR-V7mRNA，并用CellSearch进行免疫染色，分析AR-V7在核中的特异性定位。同时将原位检测与英国NAGLE公司的parsortix系统相结合，根据CTC的大小和多形性进行分类收集，观察细胞角蛋白的状态，从而对CTC的异质性（从上皮细胞到间充质细胞各阶段的分化）进行评估。该技术无需裂解CTC，以荧光信号来可视化和定量分析AR-V7的表达水平，同时定量CTC并观察其异质性，是AR-V7检测技术的重要突破。

富集CTC检测AR-V7相比其他手段高效快速、特异性高，但技术要求严格，且无CTC计数者无法对AR-V7的状态和定量进行确定。意大利的分子诊断与药物遗传研究部制定了一组标准化操作程序（SOP），从实验室和临床的角度对AR-V7的检测进行了标准化的评估验证[24]。该SOP对CT C富集和AR-V7检测的标准化规范解决了批间变异、测定误差、试剂运输（干冰运输）和储存影响（-80℃）等问题,以冻干法保存样品可极大地改善CT C中AR-V7的稳定性,减少实验室之间的质量控制差异。此外，该SOP对结果的报告形式也提出建议：阳性（>10拷贝/ml富集全血）或阴性（<10拷贝/ml富集全血）；AR-V7/AR-FL值仅适用于阳性样品。

2.3 全血中AR-V7的检测 研究认为全血中的A R-V7mRNA比CTC中更易检测,且在不同实验室之间有更高的再现性,甚至长期储存的全血样本也可检测[25]。液滴数字聚合酶链式反应 (droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)是第三代 PC R技术（dPCR）与液滴微流控技术的结合，近年来广泛应用于PCa的相关研究中。样本溶液在微流控芯片中被高效精确地分成102~107个小液滴[26]，每个液滴包含至多一个目的基因,并作为独立反应单元各自进行的PCR扩增,以含有目标基因的液滴发出荧光为阳性,根据阳性液滴比例和泊松分布对目的基因进行精密的绝对定量。有研究[27]在21间国际实验室内部对dPCR检测可变异序列的可重复性进行验证，确定了dPCR在各实验室间具有高度的可重复性，这说明AR-V7分子诊断的应用具备指导临床治疗的潜力。Seitz等[28]应用高敏感的ddPCR对长期储存在生物样本库内的85份CRPC全血样本进行AR-V7mRNA检测，15例AR-V7呈高水平，且经多变量逻辑回归分析，AR-V7是PSA应答的独立预测因子。另外，Xichun等[29]用RT-PCR直接检测保存在PAXgene®管中的46份CRPC全血AR-V7，阳性率达67.53%。上述研究虽未考虑健康献血者，但研究已表明[25]在健康献血者外周血的4000个单个核细胞中并未检测到ARV7。Fangfang等[30]离心132例CRPC患者的全血并分离出单个核细胞，以ddPCR评估AR-V7在其中的表达水平,结果显示95%的患者AR-V7转录物均超过19拷贝/μgRNA。此外，研究者通过ddPCR在CRPC患者的血浆中也检测到AR-V7,源自癌细胞释放于血液中具有脂质双分子层的纳米级细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，称为血浆外泌体[31]。尽管全血标本方便获取，但有研究[32]比较了乙二胺四乙酸（EDTA）采血管、柠檬酸盐采血管和含有防腐剂的采血管的有效性,最终只在前两种采血管室温储存48h后仍可检测到AR-V7，该结果为全血中AR-V7的检测做了细节性提示。

全血中AR-V7的检测来源简单、经济安全且具有很好的临床应用前景，然而，部分研究表明[33]AR-V7也可能存在于非恶性细胞 （如癌旁组织或良性腺体）中，但多数相关研究却未对全血样本的检测进行广泛地验证。因此，该检测手段在推广应用于临床诊疗之前仍需进一步的验证。

2.4 尿液中AR-V7的检测 研究者[34]用放射电子显微镜观察到PCa患者尿液中存在的EVs,并通过正丁醇提取到异常增加的尿囊泡相关性PSA，显示了EVs对PCa患者潜在的诊断价值。尿液EVs可浓缩分子并保护其免受高RNA酶环境的影响，能提供关于整个泌尿系统甚至全身状态的信息，甲基化DNA、miRNA、大量蛋白质和肿瘤相关代谢产物等均被证明在尿囊泡中具有可测水平[35,36]。不同分离方法对尿EVs显示出不同的亲和力,但数据表明[37]应用尿外泌体RNA分离试剂盒（NORGEN）进行分离纯化的EVs，其目的基因检出率较高，尿液中的EVs也被证明存在可测的AR-V7。有研究[38]在14名CRPC患者的尿液EVs中检测到高水平的AR-V7和低表达的AR-FL,而22名激素敏感型PCa患者的AR-V7呈低表达。该研究采用非侵入性尿液检测的方法,用基于酶联免疫吸附的纳滤单元组成的微流体装置分离EVs并快速富集，通过ddPCR定量AR-V7和AR-FL的绝对浓度 （每毫升拷贝数）。该研究首次报道了尿液中的EVs是分析AR-V7表达的可靠来源，这一无创性的方法或将开启AR-V7检测的新思路。但AR-V7的检测将影响临床决策,且以尿液为标本检测AR-V7的研究还较少,后续仍需要大量的验证研究以提供更多可靠的数据。

3 小结与展望

AR-V7是目前CRPC最具潜力的新生标记物，但在正式应用于临床前，我们仍需进行大规模的前瞻性研究对其进行验证。AR-V7的检测手段利弊各异，尚未有数据对其进行比较和统一，目前的检测水平已经打破组织活检的单一格局，在AR-V7的检测来源和检测技术上都取得了新的突破。灵敏度和特异性更高的检测手段能精确定量AR-V7的水平,使其更好地应用在晚期PCa患者的诊疗优化和预后评估中。然而，我们依旧面临诸多挑战，如何解决PCa异质性对AR-V7特异性检测的影响？检测血液和尿液来源的AR-V7是否更高效合理？如何将检测技术简单化并得到最终标准以利于推广应用？相信随着分子诊断、基因测序和生物信息等技术的进步，在科研人员、临床医生和实验室专家的深入研究后，AR-V7的精确检测将广泛应用于临床并为CRPC患者提供更多益处。