河北省重症肺炎患儿非细菌性呼吸道病原学研究

赵梦川 吴勇 黄迎彬 王乐 郭巍巍 杨硕 严小桐 李贵霞 冯志山

肺炎是儿童尤其是婴幼儿常见的呼吸道感染性疾病，在全世界范围内有很高的发病率和病死率。据WHO资料显示，肺炎目前仍然是全球5岁以下儿童死亡的首要原因[1]，全球每年有数百万儿童死于肺炎[2,3]。儿童肺炎易反复迁延,治疗不得当会引发重症肺炎[4]。重症肺炎是肺炎同时存在其他脏器的功能紊乱、衰竭以及并发症状的儿科危重症疾病，具有发病迅速、病情严重等临床特点，病死率为20%～30%，是发展中国家5岁以下儿童死亡的重要原因之一[5]。细菌、病毒及肺炎支原体是儿童肺炎的常见病原体，既往多认为细菌是导致重症肺炎的主要病原体之一；而众多的国内外研究发现流感病毒、呼吸道合胞病毒(HRSV)、腺病毒(HADV)等呼吸道病毒也可导致重症肺炎[4-7]。故充分了解儿童重症肺炎的病原体分布情况及流行病学特点，对其临床诊断、合理用药及预防控制至关重要。目前，河北省重症肺炎患儿非细菌性呼吸道病原体感染情况尚不清楚。因此，为进一步了解近年来河北省儿童重症肺炎的呼吸道病原感染情况，我们分析了2 481例于河北省儿童医院住院治疗的重症肺炎患儿非细菌性呼吸道病原体的检出情况，并结合患儿年龄、发病季节，分析本地区儿童重症肺炎的病原学特征，研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 调查对象 以河北省儿童医院重症医学科2016年1月至2017年12月2 481例诊断为重症肺炎的患儿为研究对象。其中男1 509例，女972例，男女比例为1.55∶1， 年龄分布为1个月～13岁，其中1～12个月(含12月)1 519例，占61.23%,1～3岁679例，占27.37%，4～6岁173例，占6.97%，≥7岁110例，占4.43%。

1.2 重症肺炎诊断标准 参照中华医学会儿科学会呼吸分组重症肺炎的标准[8]:(1)一般情况差；(2)有拒食或脱水征；(3)有意识障碍；(4)呼吸频率明显增快(婴儿RR>70次/min，年长儿RR>50次/min)；(5)有发绀；(6)有呼吸困难(呻吟、鼻翼扇动、三凹征)；(7)多肺叶或≥2/3的肺受累；(8)有胸腔积液；(9)脉搏血氧饱和度≤0.92；(10)有肺外并发症。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂与仪器:核酸提取试剂盒和13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(PCR毛细电泳片段分析法)购自宁波海尔施基因科技有限公司；全自动核酸提取仪Smart LabAssist-32购自台湾圆点奈米技术股份有限公司； GenomeLabTM GeXP遗传分析系统购于美国贝克曼库尔特有限公司；PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.3.2 标本采集与处理:在患儿入院24 h内使用吸痰器(参照吸痰器的使用说明书进行操作)采集其深部气道吸取物，加1 ml 0.9%氯化钠溶液，充分混匀后用于病原体核酸提取。样本采集和运送过程中应避免污染。

1.3.3 核酸提取:使用“核酸提取试剂”在全自动核酸提取仪Smart LabAssist-32上进行自动核酸提取。

1.3.4 常见非细菌性呼吸道病原体检测:使用多重RT-PCR方法[9]同时检测甲型流感病毒(InfA)、甲型流感病毒H1N1(09H1)、季节性H3N2病毒(H3)、乙型流感病毒(InfB)、HADV、博卡病毒(Boca)、鼻病毒(HRV)、副流感病毒(HPIV)、衣原体(Ch)、偏肺病毒(HMPV)、肺炎支原体(Mp)、冠状病毒(HCOV)和HRSV，具体操作步骤如下：①根据试剂说明书配制PCR扩增体系；②在PCR仪上编辑如下扩增程序并进行扩增：25℃，5 min，1个循环；50℃，15 min，1个循环；95℃，2 min，1个循环；94℃，30 s，65→60℃，30 s，72℃，60 s(65→60°C，1℃降落退火，共6个循环)；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，60 s(29个循环)；72℃，10 min，1个循环；4℃保存至电泳。③选择“Fragment”电泳方法，在GenomeLabTM GeXP遗传分析系统上进行PCR产物的毛细电泳分离(详见GenomeLabTM GeXP遗传分析系统操作说明)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，计数资料的分析采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非细菌性呼吸道病原体检出情况 在2 481份呼吸道标本中，2 049份非细菌性病原体检测阳性，检出率为82.59%。病毒检出1 944例次，检出率为78.36%，其中检出率最高的是HRV，为814例次(32.81%)，其次为HRSV 712例次(28.70%)和HPIV 255例次(10.28%)。非典型病原体共检出216(8.70%) 例次，其中Mp 170例次(6.85%)，Ch 46 例次(1.85%)。见表1。

2.2 混合感染检出情况 2 049份病原体检测阳性的标本中，546份(21.93%)至少有2种或2种以上病原体混合感染，其中483份检出2种病原体(表1)，59份标本中检出3种病原体，4份标本中检出4种病原体(表2)。814份HRV阳性标本有406份(49.88%)检出其他病原体， HRSV、HPIV、Mp、FluA、HADV、FluB、HCOV、Boca、HMPV和Ch阳性标本中分别有31.04%(221/712)、40.39%(103/255)、48.82%(83/170)、34.73%(58/167)、63.27%(93/147)、32.77%(39/119)、62.96%(51/81)、67.53%(52/77)、32.88%(24/73)和60.87%(28/46)检出其他病原体。见表2。

2.3 非细菌性呼吸道病原体的季节分布 春季和冬季病原体总检出率高于夏季和秋季，且冬季混合感染率亦高于夏季和秋季，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 13种常见非细菌性呼吸道病原体的检出情况(检出例数) 例

表2 混合感染分布情况

此外，不同呼吸道病毒的季节差异则各有特点：HRSV秋季和冬季检出率明显高于其他季节(P<0.05)；Boca在秋季检出率最高，其次为冬季；HPIV夏季和秋季检出率较高；HADV春季和夏季检出率较高；FluA和HMPV春季检出率明显增高；HRV在春季检出率低于其他季节；HCOV冬季检出率低于其他季节；FluB检出率极低，但在2016年春季出现了感染高峰。非典型病原体中，Mp秋季检出率高于其他季节，差异有统计学意义；Ch秋季检出率亦略高于其他季节，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 非细菌性呼吸道病原体的季节分布情况 例(%)

注：与春季比较，*P<0.05；与夏季比较，#P<0.05；与秋季比较，△P<0.05

2.4 非细菌性呼吸道病原体的年龄分布 1～3岁年龄组患儿的病原体总检出率和混合感染率最高，其次是1～12个月年龄组、4～6岁年龄组和≥7岁年龄组，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，不同病原体在各年龄段的检出情况不同(除HCOV外)，且差异有统计学意义(P<0.05)：HRV在1～3岁年龄组检出率最高，其次在1～12个月年龄组也有较高的检出率；HRSV在1～12个月年龄组的检出率明显高于其他3个年龄组(P<0.05)；HPIV在1～12个月年龄组检出率最高，其次是1～3岁年龄组；InfA和InfB在4～6岁年龄组的检出率最高；HADV在1～3岁和4～6岁年龄组的检出率高于1～12个月和≥7岁年龄组；HCOV在1～12个月和1～3岁年龄组检出率较高；Boca在1～3岁年龄组的检出率最高，其次是1～12个月年龄组，在4～6岁和≥7岁年龄组未检出Boca；HMPV在4～6岁年龄组的检出率最高，其次是1～3岁年龄组； Mp在≥7岁年龄组的检出率明显高于其他3个年龄组(P<0.05)，Ch在1～12个月年龄组检出率最高。见表4。

表4 不同年龄段儿童重症肺炎非细菌性呼吸道病原体的分布情况 例(%)

注：与1～12月比较，*P<0.05；与1～3岁比较，#P<0.05；与4～6岁比较，△P<0.05

3 讨论

病毒、细菌和非典型病原体均可引起儿童重症肺炎，且存在混合感染[7,10-12]。近几年，随着分子诊断学技术的不断发展与应用，国内外已有较多报道证实病毒是重症肺炎患儿的主要病因：van de Pol等[7]在入住PICU的急性下呼吸道感染患儿中采用荧光定量PCR检测病毒，其检出率高达96%。陈玉等[12]采集重症肺炎患儿的痰液、咽拭子和静脉血，分别采用病原菌培养、RT-PCR和间接免疫荧光法检测细菌、病毒和肺炎支原体，结果提示病原检测阳性率为86.65%，其中病毒感染最多见，阳性率为37.32%。本研究对2 481例重症肺炎患儿的下呼吸道分泌物进行了13种常见非细菌性呼吸道病原体的检测，检出率为82.59%，提示非细菌性呼吸道病原体是本地区儿童重症肺炎的重要病原体；其中9种常见呼吸道病毒此次均有检出，总检测率为78.36%，高于我国贵阳、重庆等地[13,14]，分析原因可能是本研究采用的检测方法为敏感性较高的多重RT-PCR，且检测的病毒种类比较多；病毒中HRV的检出率最高，其次为HRSV和HPIV，而重庆、贵阳等地的研究未将HRV纳入检测范围，故这些地区儿童重症肺炎的主要病毒病原仍是HRSV；此次研究共检出非典型病原体216(8.70%) 例次，包括肺炎支原体170例次(6.85%)和衣原体 46 例次(1.85%)，检出率高于重庆地区[15]，但低于贵阳地区[13]。

混合感染是导致儿童肺炎的重要原因之一，而且与单独细菌或者病毒感染相比，混合感染可导致更严重的炎症反应及临床表现[10]。本研究中重症肺炎患儿的混合感染率为29.1%，高于本地区急性下呼吸道感染患儿的混合感染率(23.75%)[16]，说明混合感染可能是重症肺炎的危险因素之一。混合感染中88.5%为双重感染，以HRV合并HRSV感染最常见。有报道称儿童重症肺炎的混合感染以病毒合并细菌感染多见[13,15]，而本研究中，因不能排除患儿入院前经抗生素治疗的可能，未将细菌纳入检测范围，故推测本地区重症肺炎患儿的混合感染率远远高于29.1%，建议儿科医生提高对重症肺炎患儿多病原体检测的关注。

呼吸道病毒感染多具有明显的季节性，本研究中，冬春季病原体总检出率高于夏秋两季，与以往研究结果[16]一致。而且，不同呼吸道病毒流行具有不同的季节性差异，HRSV、InfA、 InfB、HADV和HCOV OC43/HKU1主要流行季节为冬春季,HCOV 229E/NL63、HMPV主要流行季节为冬季，HRV流行季节为春秋季，HPIV3流行季节为春夏季，Boca流行季节为夏冬季[16-19]。本研究中，HRSV秋冬季检出率较高，Boca在秋季检出率最高，HPIV夏秋季检出率较高，HADV春夏季检出率较高，FluA、FluB和HMPV春季检出率明显增高，HRV在春季检出率低于其他季节，HCOV冬季检出率低于其他季节，与王胜娥等[16]的报道存在一定差异，分析本研究对象为重症肺炎患儿，王胜娥等的报导研究对象为急性下呼吸道感染患儿，而非单纯重症，说明本地区重症肺炎患儿呼吸道病毒的季节分布规律可能与非重症肺炎患儿不同。

本研究中，1～12月婴儿占61.23%，1～3岁幼儿占27.37%，可见儿童重症肺炎主要发生在婴幼儿时期。此外，本研究发现1～12月和1～3岁年龄组中，呼吸道病毒的检出率较高，而4岁及以上患儿中，Mp的检出率较高，与以往报道[10,16,20,21]一致。以往的研究发现HRV是石家庄地区5岁以上儿童急性下呼吸道感染的首要病毒病原，而本研究中，HRV在1～3岁年龄组检出率最高，其次是1～12月年龄组，说明HRV是导致本地区婴幼儿重症肺炎的重要病原之一。国内不同地区的病原学研究结果显示 HRSV 是儿童急性下呼吸道感染中最重要的病原体[22]，也是儿童重症 CAP 的首位病毒病原[13]。本研究中HRSV是1～12月年龄组患儿中检出率最高的病毒病原，与以往研究结果一致，说明HRSV是导致小婴儿重症肺炎的重要病原体。HADV可引起儿童重症肺炎的暴发流行[23]，可导致严重的肺部后遗症[24]，有一定的病死率(<5%)[25]。本研究中HADV在1～3岁和4～6岁年龄组的检出率最高，InfA和InfB在4～6岁年龄组的检出率最高，与北京地区研究结果[26]一致。与国内多数地区报道[13,16,26]一致，本研究中，HPIV、Boca及近年新发现的HCOV在3岁以下婴幼儿中检测率最高，是本地区婴幼儿重症肺炎的重要病毒病原体。HMPV亦是近年新发现的呼吸道病毒，谢正德等报道北京地区HMPV在1～<3岁组的检测率最高，王胜娥[16]报道石家庄地区HMPV感染主要集中在 2～4 岁，本研究中HMPV在4～6岁年龄组的检出率最高，其次是1～3岁年龄组，存在的差异可能与研究地区及研究对象的不同有关。

综上所述，本研究对本地区儿童重症肺炎明确病原体结果前的经验性治疗及早期病原体诊断具有重要的指导及参考意义。