NRG1在非小细胞肺癌中的表达及机制的研究

刘 静，曹书华，赵 喜，杨云琳，宁方玲 (.滨州医学院，山东 烟台 56603；.德州市第二人民医院，山东 德州 53005)

肺癌无论是发病率还是死亡率，历年来都高居恶性肿瘤的首位。在肺癌的发病占比中，小细胞肺癌总体数量稳定，但非小细胞肺癌的发病比例仍有上升趋势，且疾病谱也不断发生变化。相对于既往鳞癌占多数，最新的数据显示腺癌所占比例呈快速上升[1]。虽然靶向治疗为部分非小细胞肺癌的治疗提供了新的治疗选择，但仍有很大一部分患者疗效欠佳。 因此，明确非小细胞肺癌的发病机制，选择新的治疗靶点成为目前临床的热点和难点。

神经调节蛋白 1 (Neureg-ulin-1, NRG-1)是NRG基因家族成员之一，又称神经胶质细胞生长因子(GGF1)，它是从牛垂体中纯化而得到的[2-4]。在结构上从属于表皮生长因子家族(EGFR)。最早发现分布于发育中的心室内膜，不表达于大的动静脉及主动脉，只在心内膜和心肌微血管中表达[6]。近些年国外相关研究显示， NRG-1与多种肿瘤的发生、发展密切相关，且其发生作用的过程中导致多种与肿瘤相关的信号通路分子改变[7]。但其在肺癌中是否也存在表达异常尚未得到很好的探索。在本研究中，笔者回顾性分析了我院在2013年1月1日～2014年12月31日行肺癌根治术的患者，探讨NRG-1在肺癌中的表达及与下游信号通道蛋白PI3K的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料：在本研究中，收集2010年1月1日～2013年12月31日于德州市第二人民医院行肺癌根治术的患者石蜡标本，总计132例，分析病变组织及癌旁组织免疫组化表达。纳入标准：所有患者均经病理证实为非小细胞肺癌，且术前未行新辅助放化疗，随访资料完整。全组患者年龄32～76岁，平均(53.13±14.47)岁，根据国际抗癌联盟手术病理分期，全组分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期；其中腺癌70例，鳞癌62例。

1.2主要试剂及仪器：兔抗人NRG-1单克隆抗体、PI3K单克隆抗体及免疫组化试剂盒购自美国Abcam公司。

1.3免疫组化染色及结果判定标准：免疫组化具体过程参照试剂盒说明书进行。判定标准：阳性细胞百分率评分标准：0～10%为0分，>10%～25%为1分，>25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。阳性细胞染色强度评分标准：无着色为0分，微弱着色为1分，中等强度着色为2分，强着色为3分。将以上两组结果相乘，得出评估范围为0～12分，0分为(-)，1～2分为(+)，3～4分为(++)，5～12分为(+++)。(-)～(+)为低表达，(++～+++)为高表达。

1.4预后随访：主要采用电话随访方式，主要观察指标为总存活时间(Overall Survival，OS)，随访截止日期2018年12月31日。

1.5统计学方法：采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，相关分析采用Spearman秩相关，Kaplan-Meier生存分析描绘生存曲线，Log-rank检验比较不同组之间生存差异；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NRG-1、PI3K在肺癌中的表达：经免疫组化检测，NRG-1和PI3K阳性表达主要着色于细胞浆，部分表达于细胞膜。NRG-1在癌组织中阴性表达46例，弱阳性43例，中度阳性26例，强阳性17例，高表达率32.6%(43/132)；癌旁组织阴性表达21例，弱阳性40例，中度阳性39例，强阳性32例，高表达率为53.8%(71/132)，经χ2检验，差异有统计学意义(χ2=12.104，P=0.001)。PI3K在癌组织中阴性表达30例，弱阳性33例，中度阳性27例，强阳性42例，高表达率为52.3%(69/132)；癌旁组织阴性表达51例，弱阳性46例，中度阳性18例，强阳性17例，高表达率为26.5%(35/132)，经χ2检验，差异有统计学意义(χ2=8.340，P<0.001)。见图1。

A：NRG-1在非小细胞肺癌中阳性表达；B：PI3K在非小细胞肺癌中阳性表达

2.2NRG-1、PI3K与肺癌临床病理因素的相关性：NRG-1表达在不同分期、病理分级之间差异有统计学意义(P<0.05)，在不同年龄、性别、病理类型间差异无统计学意义(P>0.05)；而PI3K表达仅在不同分期之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 NRG-1、PI3K和肺癌临床病理特征的关系(例)

临床特征NRG-1表达高表达低表达P值PI3K表达高表达低表达P值年龄≤60岁20390.77126330.090>60岁23504330性别男30610.88643480.085女13282615TNM分期Ⅰ期8120.0156140.018Ⅱ期22312528Ⅲ期13563821病理类型腺癌25420.23834330.721鳞癌18473530病理分级高分化790.0446100.437中分化25373329低分化11433024

2.3NRG-1与PI3K表达的相关性研究：为进一步明确NRG-1与PI3K表达之间的相关性，采用Spearman秩相关检验分析二者在132例肺癌患者的表达之间的相关性，结果显示NRG-1与PI3K表达之间呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.407，P=0.012)。见表2。

2.4NRG-1、PI3K表达与预后之间的关系：至随访截止，全组患者随访时间7～86个月，平均生存时间(41.3 ±17.4)个月， 1 年生存率为93.6 %， 3 年生存率为61.3 %，5年生存率31.6 %。根据NRG-1、PI3K表达将肺癌患者分为高表达组和低表达组，通过Log-Rank检验进行比较并绘制Kaplan-Meier曲线(见图2、3)。结果显示：NRG-1低表达组OS明显差于高表达组，差异有统计学意义(χ2=5.224,P=0.022)；PI3K低表达组OS明显优于高表达组，差异有统计学意义(χ2=7.786,P=0.005)。

表2 NRG-1与PI3K之间的相关性(例)

NRG-1表达PI3K表达-++++++r值P值-4131019-0.4070.012+591019++13742+++8432

图2 NRG-1表达与非小细胞肺癌患者OS的关系

图3 PI3K表达与非小细胞肺癌患者OS的关系

3 讨论

非小细胞肺癌的发生及发展是多病因、多步骤的过程，它的病因是极其复杂的， 受到多种基因的调控，其中抑癌基因的失活和癌基因的激活与肿瘤的发生、发展密切相关。NRG-1能够诱导多功能干细胞分化的机制已经开始研究，并且发现在诱导分化的过程中microRNA作为干细胞向细胞分化的中间介质，在体外实验发现不同剂量NRG-1在不同时间干预干细胞的分化后会产生不同的结果[8,9]，最早有报道说NRG-1可以增加鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞，但不具有特异性[10]。除此之外，NRG-1还被发现参与了肿瘤的发生、发展过程。在人的食管癌中发现NRG-1的表达水平降低[11]。提示其可能在肿瘤的发生、发展过程中发挥抑癌作用。

在本研究中，通过回顾性分析非小细胞肺癌患者病理标本的NRG-1表达，发现其在非小细胞肺癌中表达降低，并且和肿瘤的分期、组织分化有关，提示其参与了非小细胞肺癌的发生、发展过程，并且与非小细胞肺癌的预后密切相关，与文献报道一致。为进一步明确NRG-1发挥作用的机制，笔者同时研究了EGFR下游信号通路蛋白PI3K的表达，发现PI3K在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，二者相关性分析显示呈明显负相关，提示NRG-1有可能通过PI3K途径对非小细胞肺癌的发生、发展及侵袭转移的过程发挥作用。

综上所述，本组实验发现NRG-1在非细胞肺癌中表达降低，并可能通过PI3K途径发挥作用，提示NRG-1可能是非小细胞肺癌的抑癌基因，可作为非小细胞肺癌的预后判断的指标之一，有望成为新的治疗靶点。