支链氨基酸对断奶仔猪肠道和肌肉氨基酸转运载体表达的影响

张宇峰，田 敏，恒景会，陈 芳，邓跃林，管武太，张世海

（华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东广州510642）

支链氨基酸（BCAA）包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，是仔猪骨骼肌蛋白质合成的重要底物，也参与动物体内的代谢调控。日粮添加BCAA 可以提高仔猪体内必需氨基酸和非必需氨基酸的含量，提高BCAA 代谢产物丙氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的肌肉净利用率，还会提高仔猪各组织中组氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的净利用率，从而促进仔猪骨骼肌发育[1]。近年来研究发现，BCAA 可通过激活mTORC1 信号通路，从而进一步激活下游信号分子S6K1 和4EBP1，调控机体蛋白的翻译合成[2]。

氨基酸转运载体是一类广泛存在于机体生物膜系统中的功能性蛋白，主要参与机体氨基酸的跨膜转运，对蛋白质的合成以及生理功能的维持有着重要作用[3]。氨基酸从肠道吸收进入血液，随后沉积进入肌肉，都需要依赖氨基酸转运载体。根据载体转运底物的特性，氨基酸转运载体在体内可以分为酸性、碱性和中性三大类。机体中有部分载体主要负责BCAA 的转运，如L 型氨基酸转运载体主要负责大多数细胞BCAA 的信号感知和传输，并启动一系列级联反应[4]。另一类BCAA 相关转运体是钠偶联中性AA 转运蛋白（SNAT2/SLC38A2）[5]。同时，氨基酸转运载体的表达也具有一定组织偏好性。转运载体 ASCT2、B0AT1、CAT-1、y+LAT1、4F2hc、Pept-1 和rBAT 在肠道中的mRNA 表达量较高[6]，而转运载体PAT1、PAT2、LAT1、ASCT2、SNAT2、EAAT1和EAAC1 在肌肉中的mRNA 表达量较高[7]。

目前，有关日粮中不同剂量BCAA 对生长猪氨基酸转运载体影响的研究还相对很少。因此，本试验旨在探索饲粮中不同剂量BCAA 对仔猪肠道和肌肉中氨基酸转运载体表达的影响，为BCAA 在仔猪日粮中的合理利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物设计 选择 18 头（10.0±0.9）kg 杜 × 长 ×大三元杂交断奶仔猪，公母比例相同，按体重和性别随机分为3 个处理组，每个处理6 头猪。分别给不同处理组中的仔猪饲喂低BCAA 缺乏日粮（L-BCAA）、BCAA正常日粮（N-BCAA）和BCAA 过量日粮（E-BCAA），基础日粮组成及营养成分见表1。在试验第21 天开始屠宰，取仔猪空肠、腰肌、咬肌和腿肌样品于-80℃液氮中保存待测。

1.2 主要仪器 PCR Express Gradient PCR 仪（HYBAID公司）、Gene Amp 7500 型实时荧光定量PCR 仪（美国应用生物系统公司）、凝胶成像系统（法国VL 产品）、Eppendorf5810R 台式高速室温离心机（德国Eppendorf公司）、DYY-III 型电泳仪、电泳槽（北京六一仪器厂）、微波炉（日本松下电器）、4℃冰箱（Haier）、- 20℃冰箱（Sanyo）、-80℃冰箱（Sanyo）。

1.3 主要试剂 Trizol 裂解液、AMV 反转录酶、DEPC处理的离心管及枪头、定量PCR 试剂盒、PCRMIX、Taq 酶、DL2000 Ladder Marker（分子量为 2 000、1 000、750、500、250、100）均购自宝日医生物技术有限公司（TaKaRa）。

1.4 mRNA 表达分析

1.4.1 RNA 的提取及实时荧光定量PCR 总RNA 提取、总RNA 中痕量DNA 的消化、样品RNA 的反转录、Real-timePCR 参照李虹仪等[8]的方法。

1.4.2 引物设计与合成 参考NCBI 中GenBank 公布的相关基因序列，用Primer Premier 5.0 软件设计各基因的上下游引物，送至上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表2 和3。

1.5 统计分析 采用 SPSS 19.0 统计软件进行 Duncan´s多重比较和方差分析，结果以平均值± 标准误表示，P＜0.05 表示差异显著，0.05＜P＜0.1 表示有趋势。

2 结 果

2.1 BCAA 对仔猪空肠氨基酸转运载体表达的影响 如图 1 所示，与 N-BCAA 组相比，L-BCAA 组中肠道中性氨基酸转运载体（ASCT2、SNAT2、B0AT1 和rBAT）、 碱 性 氨 基 酸 转 运 载 体（y+LAT、CAT1 和4F2hc）和小肽转运体（Pept1）的mRNA 表达量显著增加，而E-BCAA 组中各氨基酸转运体的表达无显著差异。

表1 基础饲粮组成及营养成分

2.2 BCAA 对仔猪腰肌氨基酸转运载体表达的影响 如图2 所示，与N-BCAA 组相比，L-BCAA 组中腰肌中性氨基酸转运载体（PAT1、PAT2、SNAT2、LAT1）、碱性氨基酸转运载体（CAT1）的mRNA 表达显著增加；而

E-BCAA 组中性氨基酸转运载体（ASCT2 和SNAT4）、碱性氨基酸转运载体（y+LAT1 和rBAT）、酸性氨基酸转运载体（EAAC1）的mRNA 表达显著降低。各组间4F2hc 和EAAT1 的mRNA 相对表达量差异均不显著。

表2 肠道相关目的基因及内参基因β-actin 引物参数

表3 肌肉相关目的基因及内参基因GAPDH 引物参数

图1 BCAA 对仔猪空肠氨基酸转运载体表达的影响

图2 BCAA 对仔猪腰肌氨基酸转运载体表达的影响

2.3 BCAA 对仔猪咬肌氨基酸转运载体表达的影响 如图3 所示，与N-BCAA 组相比，L-BCAA 组中咬肌中性氨基酸转运载体（ASCT2、PAT1 和PAT2）的mRNA表达显著降低，4F2hc 和EAAT1 转运载体的mRNA 表达显著增加；而E-BCAA 组中性氨基酸转运载体（ASCT2、PAT1、PAT2）和酸性氨基酸转运载体（EAAC1）的mRNA 表达显著降低。各组间SNAT2、SNAT4、LAT1、y+LAT1、rBAT、CAT1 的 mRNA 相对表达量差异均不显著。

图3 BCAA 对仔猪咬肌氨基酸转运载体表达的影响

2.4 BCAA 对仔猪腿肌氨基酸转运载体表达的影响 如图4 所示，与N-BCAA 组相比， L-BCAA 组中腿肌中性氨基酸转运载体（PAT1 和PAT2）、碱性氨基酸转运载体（4F2hc）转运载体的mRNA 表达显著降低；而E-BCAA 组中性氨基酸转运载体（PAT1 和PAT2）、碱性氨基酸转运载体（4F2hc 和rBAT）、酸性氨基酸转运载体（EAAT1 和EAAC1）的mRNA 表达显著降低。各组间 ASCT2、SNAT2、SNAT4、LAT1、y+LAT1 和 CAT1的mRNA 相对表达量差异均不显著。

图4 BCAA 对仔猪腿肌氨基酸转运载体表达的影响

3 讨 论

3.1 BCAA 对仔猪空肠氨基酸转运载体表达的影响 肠道是氨基酸吸收进入动物体内的第一道屏障。在肠道中存在许多氨基酸转运载体，不同氨基酸转运载体在机体中的生物学功能各不相同。如Na+依赖性中性氨基酸转运载体ASCT2 在谷氨酰胺和亮氨酸等中性氨基酸的转运交换中起着重要作用，是维持肠黏膜生长所必需[9]；rBAT 主要表达于肾脏和小肠，是阳离子氨基酸和胱氨酸的转运体[10]。CAT1 在小肠中负责转运精氨酸和赖氨酸等阳离子氨基酸[11]，而y+LAT1/4F2hc 转运体主要参与上皮细胞中阳离子氨基酸外流转运。PepT1 主要从膳食蛋白质的消化过程中转运二肽和三肽[12]。上述氨基酸转运载体在肠道氨基酸的吸收中扮演着重要角色。近年来，已经发现不同的膳食营养水平可以调控肠道营养物质转运载体在小肠的表达[13]。因此，本试验中假设日粮中不同氨基酸水平会调控肠道氨基酸和小肽转运载体的表达水平。

采食量是影响氨基酸和小肽转运载体表达的重要因素之一。Yang 等[9]研究发现，给鸡限饲可以提高小肠PepT1 的mRNA 表达。Ihara 等[14]报道，给大鼠饥饿4 d、半饥饿（50% 对照组）10 d，或给予全肠外营养（TPN）10 d 时，PepT1 的 mRNA 水平分别增加179%、161%、164%。因此，与正常蛋白日粮相比，仔猪饲喂低蛋白日粮引起的采食量减少可能是导致本研究中PepT1 表达增加的原因之一。

此外，日粮中的氨基酸水平也是影响肠道氨基酸转运载体的重要因素之一。BCAA 是组织蛋白合成的底物。越来越多的研究表明，BCAA 作为营养信号和能量来源在调节代谢和维持生理功能中起着至关重要的作用[15]。一些转运载体的表达在氨基酸缺乏时会有所增加。Li等[16]研究发现，给仔猪饲喂氨基酸缺乏日粮会降低其采食量，可导致LAT1 和SNAT2 的mRNA 和蛋白表达水平增加，从而有效地增强BCAA 的转运。此外，Palii 等[17]研究也发现，在日粮氨基酸缺乏时，也会上调一些肠道氨基酸转运载体的表达量。而日粮补充氨基酸后，由氨基酸缺乏导致的肠道氨基酸转运载体的上调，可以得到缓解。邱凯等[18]研究发现，在低蛋白日粮中补充BCAA，空肠中氨基酸转运载体ASCT2、CAT1、y+LAT、4F2hc 的mRNA 表达量显著下降或有降低的趋势。Zhang 等[6]研究发现，在低蛋日粮中补充充足的BCAA 后，与低蛋白组相比，BCAA 组内中性和碱性氨基酸转运载体mRNA 的表达水平较低。在本研究中同样观察到，饲喂L-BCAA 日粮可以增加仔猪空肠中性氨基酸转运载体（ASCT2、SNAT2、B0AT1）及碱性氨基酸转运载体（4F2hc、y+LAT、rBAT、CAT1）氨基酸转运载体的mRNA 相对表达量。这表明饲喂氨基酸缺乏日粮的动物对氨基酸的生物利用率高于采食正常氨基酸日粮的动物[19]。氨基酸转运载体表达的增加是补偿低蛋白日粮中氨基酸底物浓度不足的一种机制[16]。另一种机制可能是当BCAA 缺乏时，氨基酸转运载体表达的增加将更多的氨基酸从细胞中运出[20]。Li 等[16]研究表明，低蛋白（17%CP）日粮添加BCAA 后生长猪的生长性能可达到正常蛋白（20%CP）日粮水平，即各氨基酸底物能满足仔猪的正常生长需求。本研究中，低蛋白（17.45%CP）日粮添加BCAA 后，氨基酸转运载体表达的增强得到缓解，与Li 等[16]研究一致。这一结果提示，适量BCAA 能补偿低蛋白日粮中氨基酸底物供应不足的问题。蛋白质的合成是一个消耗能量的过程，作为一种重要的细胞能量传感器，AMPKα被ATP激活后，可以传递维持能量稳态的信号[21]。随着转运载体表达水平提高，P-AMPKα磷酸化随之增强，但添加BCAA 会抑制P-AMPKα活性，即补充亮氨酸可抑制AMPKα磷酸化[22]，使得氨基酸转运载体表达降低。综上所述，BCAA 可能通过调节小肠中氨基酸转运载体的表达来维持正常的肠道发育和氨基酸的生理吸收。

3.2 BCAA 对仔猪肌肉氨基酸转运载体表达的影响 骨骼肌发育与氨基酸的肌肉净利用率相关[1]。Suryawan等[23]研究发现，BCAA 和其他氨基酸相比具有更多的生理调控功能，包括促进蛋白质的合成、抑制蛋白质的降解、调节采食量以及提高机体免疫等。张世海[24]研究表明，在日粮中添加异亮氨酸（LP+Ile，17.5%CP）能增强断奶仔猪肌肉葡萄糖转运载体GLUT1 和GLUT4的表达。BCAA 可能通过影响不同部位氨基酸转运载体的表达来调节机体代谢的动态平衡。因此，推测日粮中不同氨基酸水平能调控断奶仔猪肌肉中氨基酸转运载体的表达。

日粮中的氨基酸水平是影响骨骼肌氨基酸转运体重要因素之一。Duan 等[25]研究发现，减少膳食粗蛋白质含量会增加猪骨骼肌中氨基酸转运体SNAT2 和LAT1的表达。Zhang 等[26]研究发现，随着日粮中缬氨酸浓度的降低，血浆中蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺浓度会增加。在骨骼肌中，转运载体（SNAT2 和SNAT4）介导着大多数谷氨酰胺的双向跨膜运动[27]。研究表明，血浆中的天冬氨酰等中性氨基酸是通过氨基酸转运载体LAT1 被肌细胞吸收，对血管平滑肌的生长至关重要[28]。EAAC1 和EAAT1 是谷氨酸的关键转运载体[29]。Wiltafsky 等[30]研究发现，饲喂低蛋白日粮时，血浆中精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸的浓度会增加，而CAT1 主要负责精氨酸等阳离子氨基酸的转运。另外，也有研究报道，PAT1 和PAT2 不仅负责各种小型氨基酸的运输，它们也有能力作为超受体来影响肌肉蛋白质代谢[31]。Yin 等[32]研究发现，给仔猪饲喂亮氨酸缺乏日粮时血浆中的赖氨酸和色氨酸高于正常蛋白组，而4F2hc 主要负责上皮细胞中赖氨酸的外流转运。本研究中，同样观察到饲喂L-BCAA 日粮会上调仔猪腰肌中（PAT1、PAT2、SNAT2、LAT1 和CAT1）、咬肌中（4F2hc和EAAT1）氨基酸转运体的表达。这与先前的研究一致，即饲喂低蛋白日粮时，血液中氨基酸浓度的增加促进了骨骼肌中一些氨基酸转运载体的表达。

此外，Yoshizawa 等[33]研究发现，对缺乏食物的大鼠口服亮氨酸可促进骨骼肌蛋白质的合成，抑制肌纤维蛋白的降解。Zheng 等[34]研究发现，日粮中添加BCAA 可促进骨骼肌蛋白质的合成，抑制蛋白的降解。本研究也发现，饲喂L-BCAA 日粮时，仔猪咬肌中（ASCT2、PAT1 和PAT2）、腿肌中（PAT1、PAT2 和4F2hc）氨基酸转运载体的mRNA 相对表达量会降低，而在补充BCAA 后氨基酸转运载体的表达明显提高。说明适量的BCAA 可以促进骨骼肌氨基酸转运载体的表达。氨基酸转运载体ASCT2 主要负责亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等中性氨基酸的转运交换，BCAA 缺乏会影响咬肌中ASCT2 的表达。有趣的是BCAA 缺乏使咬肌中（PAT1 和PAT2）和腿肌中（PAT1 和PAT2）氨基酸转运载体的表达量降低，而腰肌中（PAT1 和PAT2）的表达反而会增加。这说明同种氨基酸转运载体在不同组织中的表达会不同，具有一定的组织偏好性[25]。

Wessels 等[35]研究发现，高浓度亮氨酸会促使缬氨酸和异亮氨酸分解加强，给仔猪饲喂过量亮氨酸日粮时，几乎所有组织中的游离缬氨酸和异亮氨基酸的浓度会降低。血浆中半胱氨酸浓度随日粮中异亮氨酸和缬氨酸浓度的增加而降低[27]。因此，推测高浓度BCAA 对血液中其他氨基酸的转运会有抑制作用。本试验结果显示，当饲喂E-BCAA 日粮时，会降低腰肌中（ASCT2、SNAT4、y+LAT1、rBAT、EAAC1）、咬肌中（ASCT2、PAT1、PAT2、EAAC1）、腿肌中（PAT1、PAT2、4F2hc、rBAT、EAAT1、EAAC1）氨基酸转运载体的表达。这与Suryawan 等[23]的研究一致，即BCAA 过多会抑制AMPKα磷酸化，从而抑制骨骼肌中氨基酸转运载体的表达。综上所述，BCAA 可能通过调节肌肉中氨基酸转运载体的表达来维持正常的肌肉发育。

4 结 论

日粮中BCAA 水平在调控仔猪肠道和骨骼肌氨基酸转运载体mRNA 的表达中扮演重要角色。BCAA 不足会增加肠道氨基酸转运载体（ASCT2、SNAT2、B0AT1、Pept1 及 4F2hc、y+LAT、rBAT 和 CAT1） 的 表 达；而BCAA 过多时会抑制腰肌（ASCT2、SNAT4、y+LAT1、rBAT、EAAC1）、咬肌（ASCT2、PAT1、PAT2、EAAC1）和腿肌（PAT1、PAT2、4F2hc、rBAT、EAAT1、EAAC1）中氨基酸转运载体的表达。