乙型肝炎患者治疗过程中血清USP7、IL-6、TNF-a的动态变化及相关性研究

马玉 张咪 王雪

摘要 目的：初步探讨泛素特异性蛋白酶7（Ubiquitin-specific proteases7，USP7）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）在乙型肝炎患者血清中的动态表达及其与肝功指标的相关性。方法：收集不同时间点乙型肝炎患者的血清，采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测98例乙型肝炎患者入院治疗前和治疗1w、2w、3w、4w血清中USP7、IL-6、TNF-α的表达水平，并分析USP7及炎症因子与肝功指标的相关性。结果：USP7在乙型肝炎患者治疗过程中呈现规律变化，并且随着治疗时间的延长，蛋白表达水平逐渐下降，且治疗1w、2w、3w、4w后血清USP7、IL-6、TNF-α与治疗前相比差异均有统计学意义（P<0.05）。USP7蛋白表达量与IL-6、TNF-a的表达呈正相关（P<0.05）。结论：USP7可能参与乙型肝炎的发展进程，并且与乙型肝炎病毒感染导致的肝脏炎性损伤有一定联系。

关键词 USP7;乙型肝炎;炎症

中图分类号  R512.62    文献标识码  B    文章编号  1671-0223（2020）02-029-04

Abstract   Objective To survey the dynamic changes of USP7， IL-6 and TNF-α in serum of patients with hepatitis B and its correlation with ALT and AST. Methods The expression of USP7，IL-6，TNF-α detected by ELISA and liver function indicators correlation. Results USP7 showed regular changes during the treatment of hepatitis B patients， and with the prolongation of treatment time， the protein expression level gradually decreased， and serum USP7， IL-6， TNF-α， ALT， AST， etc. after 1w， 2w， 3w， 4w treatment There were significant differences between the two groups （P <0.05）. The expression of USP7 protein was positively correlated with the protein expression of ALT， AST and IL-6， TNF-α （P <0.05）. Conclusion USP7 may be Participate in the development of hepatitis B and have a certain relationship with liver inflammatory damage caused by hepatitis B virus infection.

Key words USP7; Hepatitis B; Inflammation

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的以肝臟慢性炎性损伤为主的传染病[1，2]。目前，HBV已呈世界性大流行，我国是HBV感染高发区，其慢性炎症引起的肝炎后肝硬化、乙型肝炎相关肝癌更是不容小觑[3]。因此，有效的监测乙型肝炎的发展并及时给予干预措施显得尤为重要。

近年来，在肝病的机制研究中，表观遗传因素受到了越来越多的关注。其中，蛋白的泛素化、去泛素化是表观遗传的重要组成部分，且在肝病发生过程中发挥着十分重要的作用[4，5]。这为乙型肝炎的研究提供了新的视角。泛素特异性蛋白酶（USPs）是构成去泛素化酶的最大亚家族，它是从特定蛋白质底物中去除泛素，以防止它们被靶向蛋白酶体降解的一种去泛素化酶[4，5]。作为USP家族的一员，USP7（与疱疹病毒相关的USP，HAUSP）是一种进化上保守的蛋白，最初被认为是单纯疱疹病毒蛋白Vmw110的结合配偶体，同时也为细胞生长控制，细胞周期调控，受体功能，发育和应激反应所必需[6]。近期有研究表明，USP7在HBV相关肝癌中呈现高表达[7]，还有研究表明，USP7与炎症信号通路NF-κB相互作用[5]且NF-κB可以调控多种炎症因子，而在HBV感染状态下，T细胞是清除细胞内病毒最主要的效应细胞。T细胞可产生多种细胞因子，如：IL-6、TNF-a等，在HBV的免疫应答中起核心作用。因此，我们推测，USP7在乙型肝炎的进程中起着一定的作用。

本研究对乙型肝炎患者治疗不同阶段的血清USP7及炎症相关因子进行动态监测，以期为预防HBV导致的肝损伤进一步恶化提供证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年8月-2018年12月在石家庄市第五医院被诊断为乙型肝炎的住院患者作为观察对象，共98例，其中男性71例，女性27例。入组患者的临床资料及肝功指标由石家庄市第五医院检查记录或问卷调查获得。所有患者均签订知情同意书。

1.2 纳入排除标准[8]

纳入标准：符合中华医学会肝病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015版）诊断标准。

排除标准：孕产妇;除HBV外的其他病毒感染者;合并其他类型肝病的患者;合并严重代谢性、免疫性疾病;近1个月内有输血史者等[8]。

1.3 问卷调查[8]

收集研究对象的一般资料（性别、年龄、民族、吸烟、饮酒等）抗病毒治疗方案、个人病史及用药史等。

1.4 血标本处理[8]

收集每个纳入患者入院治疗前第一份静脉血1.5mL，治疗1w、2w、3w、4w后静脉血1.5mL，12000rpm离心5min，取上清于EP管中，-80℃保存备用。

1.5 ELISA法检测USP7及IL-6、TNF-α的蛋白表达水平[8]

试剂盒由北京安迪华泰科技有限公司提供，试剂盒室温平衡20 min后取出板条，设置标准孔和样本孔，标准孔加不同浓度标准品各50 μL，样本孔加细胞上清液10 μL同时加入40 μL样本稀释液，各孔加入辣根过氧化物酶（HRP），封板膜封住，37 ℃温育后，洗板5次，每孔加入底物A、B，37 ℃温育后，加终止液，酶标仪检测OD值，最后通过标准曲线方程计算蛋白含量。

1.6 统计分析

采用SPSS23.0进行数据处理，非正态分布计量资料（USP7、IL-6、TNF-α等）用“中位数（四分位间距）”进行统计描述，组间中位数比较采用非参数检验;各指标间的相关性采用spearman相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象临床资料

98例研究对象的性别、年龄等临床特征见表1。

2.2 乙型肝炎患者血清中USP7、IL-6、TNF-a蛋白表达变化

结果显示，随着治疗周期的延长，USP7、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平也逐渐降低，且治疗1w、2w、3w、4w与治疗前相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。提示，USP7可能参与了HBV导致的炎症反应。见图1、图2。

2.3 USP7与IL-6、TNF-a、ALT、AST的相关性分析

结果显示，乙型肝炎患者血清USP7蛋白表达量与ALT、AST及IL-6、TNF-a的蛋白表达量均呈正相关（P<0.05）。提示，USP7可能参与调控HBV导致的肝脏炎性损伤。见表2。

3 讨论

中国甲乙类法定报告传染病中，乙型肝炎的发病率和死亡率均位列前三，不容小觑。乙型肝炎病毒（HBV）是一种肝嗜酸病毒，可通过免疫反应性在人类体内建立持久性和慢性感染[8]。目前，HBV感染導致乙型肝炎的发病机制尚未明确，有研究指出HBV是通过诱导机体免疫反应，产生多种炎症因子，从而导致肝脏炎症性表现[9，10]。因此，对乙型肝炎病程及其肝损伤的程度进行有效监测，阐明其机制并找到灵敏的监测指标对乙型肝炎的发生发展具有重要意义。

USP7作为泛素特异性蛋白酶家族中的一员，有研究指出，它不仅作用于癌蛋白与抑癌蛋白，还可与病毒相关蛋白相互作用[11]。而乙型肝炎又是HBV病毒感染导致的传染性疾病，推测，USP7在乙型肝炎中起调控作用，因此，本研究对USP7进行动态监测，结果显示，USP7的表达是随着乙型肝炎治疗而逐渐降低的，且USP7与ALT、AST的表达呈正相关，提示，USP7与HBV感染导致的肝损伤有关，并可能参与了乙型肝炎的进展。

TNF-α作为重要的炎症介质，在HBV病毒感染时可促进T细胞产生大量炎症因子，使肝细胞的氧化应激反应增强[12]。IL-6作为多功能细胞因子，可直接参与肝脏炎症反应和损伤过程[13]。研究发现，IL-6可通过多种信号通路，调控肿瘤细胞周期和基因表达[14]。HBV感染后炎性损伤最易出现，且最常见的异常表现是血清转氨酶升高。临床上，反应乙型肝炎肝脏损伤的实验室检查指标为ALT、AST，且与用药直接相关。因此，本研究对TNF-α、IL-6等促炎因子以及肝损伤指标ALT、AST进行监测，用以观察肝脏炎性损伤情况，本研究结果显示，随着治疗周期的延长TNF-α、IL-6的表达呈下降趋势，并且与刚入院未治疗前相比，TNF-α、IL-6表达水平明显降低，并与肝功指标ALT、AST变化趋势一致，提示肝脏炎症损伤减轻;通过相关性分析发现去泛素化酶USP7蛋白表达与IL-6、TNF-α表达均成正相关，提示，USP7可能参与调控乙型肝炎炎症反应，有研究表明，USP7与炎症信号通路NF-κB相互作用[15，16]。同时，有研究也显示USP7与病毒蛋白也能发生相互作用[11]，因此，推测，在本研究中USP7可能是通过去泛素化NF-κB在HBV诱导的肝脏炎症反应中起作用的，也可能是通过与病毒蛋白相互作用在乙型肝炎炎症损伤中发挥功能的。这还需要进一步通过体内体外实验进行深入探究。

综上，USP7可能参与了乙型肝炎的发展进程，其具体机制尚不明确，本课题组将继续通过体内、体外等实验探究去泛素化酶USP7调控炎症的作用机制，以期为临床上早发现、诊断和治疗HBV感染引起的肝脏炎性损伤提供新思路。

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[2020-01-07收稿]