酚酸类化感自毒物质对枸杞种子萌发的抑制作用

李 敏,闫兴富,马 丽,马 璐,时 榕

1 北方民族大学生物科学与工程学院, 银川 750021 2 北方民族大学国家民委生态系统模型及应用重点实验室,银川 750021

化感作用(Allelopathy)是生态系统中存在的普遍现象,指部分植物(也包括部分微生物)释放某些化学物质至外部环境,从而对邻近个体的生长发育产生影响[1]；此类化学物质被称为化感物质,主要来源于高等植物次生代谢产物,其化学本质多为小分子有机化合物。如果化感物质的供体和受体是同一种植物,且对该植物的生长发育产生不利影响,则这种现象被称为自毒作用(Autotoxicity),是化感作用的一种特殊形式[2- 3]。自毒作用往往在农业生产领域产生负面效应。

植物残体分解、根系分泌以及雨露淋溶是自毒物质进入外部环境的主要途径[4- 5]。农田长期耕种同一作物,容易导致同一类自毒物质在土壤介质中累积,尤其在作物根系附近土壤形成高浓度微环境[6- 7]。当自毒物质积累到一定量时,即可对植物产生毒害作用,作用机制较为复杂。以酚酸类自毒物质为例,研究发现该类物质可对植物细胞膜的通透性、酶的含量与活性、矿物质元素的吸收与利用、蛋白质和核酸的代谢、光合作用等生理活动产生负面影响[8-11]。此外,自毒物质与土壤理化性状劣变、根际微生物种群劣变等也存在关联[11- 15],被认为是导致农业生产连作障碍的重要诱因之一[16- 17]。

枸杞(LyciumbarbarumLinn.)为茄科植物,是落叶的多年生小灌木。目前,受道地性产区土地资源紧缺和农民种植习惯等因素制约,连作障碍日趋突出[18- 19],应给予足够重视。然而,关于枸杞连作障碍成因的研究十分匮乏。已有研究证实以阿魏酸、香草酸和肉桂酸等为代表的酚酸类有机酸是番茄[13]、西瓜[20- 21]、苜蓿[22]、山桃[23]、杨树[24- 25]等众多作物的主要化感自毒物质,上述酚酸在枸杞植株体内含量较高[26- 27],阿魏酸是枸杞根际分泌物的主要成分[28]。随着连作年限的增加,上述化合物在枸杞根际微环境中不断累积,很可能成为枸杞连作障碍的潜在诱因。检验化感物质对待试植物种子萌发的影响,是化感物质活性研究的一种主要方法,因为种子萌发是植物生命周期中非常敏感和重要的一个阶段,研究结果具有一定的代表性。定量构效关系(Quantitative structure-activity relationship, QSAR)研究方法利用化学、数学、计算机和生命科学等交叉学科技术,将化合物的生物活性与分子结构联系起来,可一定程度揭示化合物分子与生物受体相互作用机制。因此,本文全面考察常见酚酸类物质对枸杞种子萌发过程的化感自毒作用,并利用3D-QSAR中比较分子场分析法(Comparative molecular field analysis, CoMFA),揭示该类化合物分子结构特征与其化感自毒活性之间的内在关系,为酚酸类物质对枸杞的化感自毒作用研究以及枸杞连作障碍成因的解析提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

高压灭菌锅、9 cm玻璃培养皿、9 cm圆形滤纸、锡箔纸、恒温培养箱等。

枸杞果干(宁杞1号)、高纯水(采用Milli-Q制备,电阻率大于18 MΩ·cm),酚酸类化合物(种类见表1)购自阿拉丁试剂(中国,上海),纯度≥97%,10%次氯酸钠溶液。

1.2 种子萌发培养及化感自毒活性测定

9 cm玻璃培养皿中垫入2层滤纸,高压蒸汽灭菌(121 ℃、15 min)制备成滤纸床。将枸杞干果于高纯水中浸泡过夜,轻轻碾碎果肉后取枸杞种子,于室温下晾干。采用10%次氯酸钠溶液浸泡枸杞种子消毒10 min,用无菌水反复漂洗数次后将种子移至滤纸床,每个滤纸床(培养皿)中放入10粒种子。在温度为28±0.5 ℃的培养箱中遮光培养7 d,其中培养伊始于每个滤纸床中加入7 mL不同浓度酚酸溶液,第4天于每个培养皿中续加3 mL溶液。

对每一个酚酸化合物设置0(即7 mL无菌水,空白对照CK)、25、50、75、100、125、150 mg/L 7个浓度梯度。以单个滤纸床为1个平行计,每个酚酸浓度设置3个平行。

每天监测各个滤纸床中种子的萌发情况,7天后测定胚根长、胚轴长,并通过计算酚酸类化合物对种子萌发、胚根生长和胚轴生长的抑制作用(以抑制率定量计算),绘制浓度-抑制率计量效应曲线,求取半抑制浓度IC50,分别表示为IC50,萌发率、IC50,胚根长和IC50,胚轴长,定量评价酚酸对枸杞种子萌发过程的抑制效应；其中,抑制率(%)=(空白对照CK-处理)/空白对照CK×100%。

1.3 三维定量构效关系建模

图1 22种酚酸类化合物分子叠合图Fig.1 Overlay chart of the 22 phenolic acids

定量构效关系建模分析中,生物活性数值采用以摩尔浓度单位计的IC50(μmol/L)数值,具体见表1。3D-QSAR分析采用比较分子场分析方法,所有的操作均采用 SYBYL 7.0 软件各模块完成。酚酸类化合物分子结构优化使用 Tripos 力场,分子电荷采用Gasteiger-Huckel电荷,能量最小化计算过程中,Gradient阈值为0.005。采用生物活性最大(以摩尔浓度计IC50,胚根长最小)化合物2,3,4-三甲氧基肉桂酸为模板,使用 Align Database 方法将所有分子进行叠合。其叠合效果如图1所示。将叠合好的分子置于默认的三维网格(2 Å grid)中,按照默认的探针(+1价sp3杂化C原子)、步长(1.0) 以及能量阈值(30 kcal/mol)进行CoMFA分析,未进一步说明的参数均采用 SYBYL 软件默认设定值。统计学分析采用偏最小二乘(Partial Least Squares Analysis, PLS)方法建立模型,采用抽一法(Leave-One-Out, LOO)进行交叉验证。

表1 酚酸类化合物对枸杞种子萌发的化感自毒作用实验值与模型分析值

CAS No.: 美国化学文摘登记号,chemical abstracts service number

2 结果与分析

2.1 酚酸类化合物抑制枸杞种子萌发的剂量效应

22种酚酸类化合物对枸杞种子萌发的化感作用测定结果如表1所示,22种酚酸类化合物在较高浓度下均能抑制枸杞种子的萌发；分别采用抑制种子萌发、胚根生长和胚轴生长获得的IC50数值范围为78.88—115.97、56.47—81.72和39.94—80.56 mg/L；对比各IC50数值大小发现,IC50,胚根长和IC50,胚轴长数值比IC50,萌发率更低,表明采用抑制胚根、胚轴生长指标评价酚酸类物质的化感自毒活性更灵敏。统计学分析发现在0.05水平上IC50,胚根长和IC50,胚轴长呈显著正相关,Pearson相关系数为0.498,IC50,萌发率与上述两个指标无相关性。

本研究囊括的酚酸类化合物化学分子结构均包含苯环和活性羧基结构,具有较大的共性,但苯环上取代基类型和数量、取代位点等构成了酚酸类化合物结构的多样性,实验结果显示各化合物对枸杞种子萌发的化感自毒活性表现出了极显著差异(P<0.01),酚酸类化合物化感活性和结构之间的关系值得深入探讨。

2.2 酚酸类化合物抑制枸杞种子萌发的定量构效关系

2.2.1CoMFA建模统计学分析

经多次尝试,发现以IC50,胚根长(μmol/L)数据构建的CoMFA模型最优,其统计学参数见表2。交叉验证相关系数Q2为0.802,表明获得的模型具有较高的自身一致性；在95%置信度水平进行非交互验证,得到模型的相关系数R2为0.938。立体场与静电场的贡献值分别为48%和52%,说明酚酸化合物分子结构立体场和静电场对其化感自毒活性都有影响,其中静电场作用稍强。

表2 CoMFA模型的偏最小二乘法分析结果

Q2：交叉验证相关系数,cross-validated correlation coefficient；R2：非交互验证相关系数,non-cross-validation analysis correlation coefficient；SEE：估算值标准误差,standard error of estimate；F：费歇尔检验值,the Fisher test value；NC,最佳主成分数,the optimum number of components

2.2.2CoMFA三维等高图分析

酚酸类化合物对枸杞种子萌发抑制作用的构效关系CoMFA三维等高图如图2所示。在立体场中,绿色表示增大基团体积会导致化感自毒活性增加,黄色表示增大基团体积会使化感自毒活性降低；在静电场中,红色表示增加带负电基团会导致化感自毒活性增强,蓝色表示增加带正电基团会导致化感自毒活性增强。

图2 CoMFA模型三维等高图Fig.2 Contour maps of CoMFA model

在CoMFA模型的立体场中,苯环母核1、2、3和4号位上均覆盖了大面积的绿色色块,代表在上述4个取代基位点存在大体积取代基会增加酚酸类化合物的化感自毒活性。苯环1号位取代基构效关系如表3所示,比较苯甲酸与肉桂酸分子结构,发现两者除1位取代基存在差异外其余分子结构均相同,前者1位取代基为羧基,后者为苯烯酸,二者的化感自毒活性随1位取代基体积增大而呈增加的趋势；4-羟基苯甲酸与对香豆酸、3,4-二羟基苯甲酸与咖啡酸、香草酸与阿魏酸、丁香酸与芥子酸,上述4组化合物分子结构特征与化感自毒活性大小也符合这一规律。苯环2号位取代基构效关系如表4所示,比较苯甲酸与水杨酸、肉桂酸与2-甲氧基肉桂酸、对香豆酸与2,4-二羟基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸与2,3-二甲氧基肉桂酸上述4组化合物,发现在其他分子结构一致的前提下,在苯环2号位上增加羟基或者甲氧基取代基团,取代位点处分子体积增大,相应化感自毒活性增强。苯环3号位取代基构效关系如表5所示,比较4-羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸与香草酸,三者分子结构除3号位点外其余结构特征均一致,在苯环3号位上增加羟基或甲氧基取代基团、或者甲氧基替换羟基取代基,导致3号位取代基体积增大,相应化感自毒活性呈增加趋势；肉桂酸、3-羟基肉桂酸与3-甲氧基肉桂酸,香豆酸、咖啡酸与阿魏酸,2-甲氧基肉桂酸与2,3-二甲氧基肉桂酸,上述3组化合物苯环3号位取代基呈现出的构效关系也符合这一规律。苯环4号位取代基构效关系如表6所示,对比苯甲酸与对羟基苯甲酸等4组化合物,发现苯环4号位取代基体积大小与化感自毒活性构效关系规律与3号位取代基的一致。以上实验结果与CoMFA模型立体场色块图指示的构效关系规律契合良好。

表3 酚酸类化合物1号位取代基构效关系

表4 酚酸类化合物2号位取代基构效关系

在CoMFA模型的静电场中,苯环母核1号位置上覆盖了红色色块,代表1号取代基存在电负性较大的基团,会导致化合物化感自毒活性增强。如表3所示,对比肉桂酸类衍生物和苯甲酸类衍生物,前者丙烯酸基团的电负性高于后者的羧基,前者的化感自毒活性也强于后者。上述实验结果与CoMFA静电场等势图显示的结果完全一致。

3 讨论

3.1 酚酸类化合物对枸杞种子萌发过程的化感自毒效应

在农业生产领域,连作障碍诱因众多,酚酸类物质是近年来研究较多的热点之一。枸杞种子粒径小、种皮较薄,考察枸杞种子萌发阶段对外源酚酸类物质胁迫的响应,对判断酚酸是否为导致枸杞连作障碍的诱因具有重要意义。本研究结果显示,酚酸类物质对枸杞萌发产生胁迫的浓度范围(IC50数值)为39.94—115.97 mg/L。对比已有研究结果,酚酸类化合物对山桃、苜蓿、花生、水稻、人参种子萌发或幼苗生长产生显著化感自毒效应的浓度水平分别为0.1—10 mg/L[23]、0.5—500 mg/L[22]、5 mg/L[11]、50—500 mg/L[29]、>25 mg/L[30]；由此可见,酚酸对作物产生化感效应与作物种类及浓度有关,不同酚酸对不同作物的作用阈值差异较大。

酚酸类化合物可以导致植物化感自毒作用,这一论断一直存在争议[5],其主要原因在于实际植物根系土壤环境中,酚酸类物质的含量多在μg/g的水平[6,24,31],显著低于实验室条件下获得的抑制作用浓度水平。本研究亦发现,单一酚酸引起枸杞种子萌发过程化感自毒作用的浓度阈值较高。然而,在自然界一种作物根系中,往往共存数种酚酸类化合物[6,10,15]。有学者认为,与实验室获得的单一酚酸对植物的化感作用相比,复合酚酸对植物的影响更大[10]。植物残体浸提物是复合化感物质的重要来源,但其组成复杂,对主成分定量研究及化感作用机理研究造成一定困扰。实验室体系中复合酚酸对植物的化感作用,目前还未见报道。

3.2 酚酸类化合物抑制杞种子萌发的定量构效关系

本研究在囊括常见植物根系分泌物中酚酸类物质的同时,将部分化学分子结构类似的酚酸类化合物也纳入研究范围,应用CoMFA方法考察酚酸类物质对枸杞种子萌发过程的化感自毒活性的构效关系。结果显示,该类化合物的立体效应和静电效应是描述其化感自毒活性和进行构效关系研究的重要结构参数。在建模过程中,本研究也尝试了比较分子相似性指数法,将分子的疏水性质、氢键供体和受体性质也纳入考察范围,发现上述三种结构描述符对酚酸化合物的化感自毒活性影响不大(数据未显示)。

CoMFA作为3D-QSAR研究的有力工具,在环境科学、生态毒理等领域应用广泛,本研究初步将CoMFA应用于农业生产领域的化感作用研究,获得了较好的解析酚酸类物质化感自毒活性构效关系的定量数学模型。三维等高图揭示出的构效关系规律可为该类化合物与生物体作用产生毒性作用机理的探讨提供理论依据。

4 结论

在较高浓度水平,外源酚酸对枸杞种子的萌发均产生抑制作用,分别以抑制种子萌发、胚根生长和胚轴生长作用计,IC50数值范围为78.88—115.97、56.47—81.72、39.94—80.56 mg/L；其中,阿魏酸、2,3-二甲氧基肉桂酸、咖啡酸等含有甲氧基、羟基官能团的肉桂酸衍生物抑制作用较强。基于CoMFA方法构建酚酸化合物分子结构与其对枸杞种子萌发化感作用的构效关系,获得模型的交叉验证系数Q2为 0.802,非交叉验证系数R2为0.938,证明模型稳健可靠；三维等势图揭示出酚酸类化合物立体效应和静电效应是描述其化感自毒活性的重要参数。

致谢：本研究工作得到中国科学院生态环境研究中心杜宇国和魏东斌研究员的帮助，特此致谢。