冠心病血瘀证基因组学研究进展＊

刘兰椿，何庆勇，陈恒文，傅梦薇，周思远，王 阶＊＊

（1. 中国中医科学院广安门医院 北京 100053；2. 北京中医药大学研究生院 北京 100029）

冠心病血瘀证的现代研究认为，血瘀证是血液及其循环系统形态与功能异常的综合体现，主要与微循环异常、炎症反应和血管内皮损伤等有关。采用蛋白质组学和代谢组学技术可探索冠心病血瘀证状态下蛋白质的特异时空表达，而蛋白质的本质是基因的相互作用，信使RNA（messenger RNA，mRNA）则是连接基因和蛋白质的枢纽。基因组学（Genomics）是阐明整个基因组的结构、功能以及相互作用的科学，包括以全基因组测序为目标的结构基因组学、以基因功能鉴定为目标的功能基因组学、比较已知基因组结构的比较基因组学。运用基因组学技术可筛选在冠心病血瘀证中扮演重要角色的基因，作为区分冠心病血瘀证患者和健康者的生物标志物，其介导的生物过程能在一定程度上调控血瘀证的发生发展。基因组学技术也为冠心病血瘀证中药复方的多靶点调控提供了依据，通过药物靶基因的变化趋势可验证冠心病血瘀证治疗的效果，更为新药研发提供了理论基础。然而通过对既往单个文献的整理发现，冠心病血瘀证基因组学研究的样本量较少，多项研究指标尚缺乏系统性，故这项系统评价的目的是：梳理冠心病血瘀证基因组学的研究进展；总结归纳冠心病血瘀证基因组学研究的思路方法。

1 资料与方法

1.1 文献纳入与排除

1.1.1 纳入标准

该研究的纳入标准如下：①受试者同时符合冠心病和血瘀证诊断标准；②主要结局指标涵盖基因多态性位点、差异基因表达水平、基因甲基化修饰情况。

1.1.2 排除标准

该研究的排除标准如下：①综述或述评；②动物实验；③重复文献；④血瘀证合并其他证候或未采取基因组学技术。

1.2 文献检索

2003年人类基因组计划的完成标志着医学遗传学和基因组学进入后基因时代。计算机检索Medline、Cochrane Central Register of Controlled Trials、中国知网、万方数据库从2003年1月-2020年1月之间的文献。在搜索策略中，本研究选择以下术语做为主题词（包括标题、摘要、关键词）：“冠心病”“血瘀证”“基因”“胸痹”“活血化瘀”“Coronary Artery Disease”“Coronary Heart Disease”“Blood Stasis”“Promote Blood Circulation”“Genomics”等（附录）。

1.3 信息筛选与提取

2 名研究人员（刘兰椿和傅梦薇）独立搜索数据库筛选所有检索记录的标题和摘要，以排除不相关的研究，通过阅读全文评估剩余的研究，任何分歧都是通过协商一致或通过仲裁者（周思远）来解决的。随后研究人员对纳入的文献进行信息提取，内容包括文献的作者、发表年份、介导的生物过程、差异基因片段、差异基因表达的方向、分组资料、基因组学检测技术分类等。

2 冠心病血瘀证基因组学研究类型

初步检索出335 篇相关文献，其中包括中国知网的187 篇、万网数据库的106 篇、Medline 数据库的12篇、Cochrane Central Register of Controlled Trials 数据库的30篇，利用文献管理软件Noteexpress 剔除了重复的96 篇研究，去重后剩余文献239 篇。对剩余文献阅读文题和摘要初筛删除133 篇内容不符、主题无关的文献，剩余106 篇文献进行阅读全文复筛。全文复筛后排除了72 篇文献，其中7 篇综述或述评、8 篇动物实验、32 篇临床资料重复、25 篇为血瘀证合并其他证候或未采取基因组学技术。清理数据后，最终纳入定性分析的文献数为34篇（表1）。按照研究的类型大致可分为基因多态性、差异基因的表达、基因的甲基化修饰3个方面。

表1 纳入研究一般情况特征表

续表1

2.1 基因多态性

纳入的文献中共有22 篇由单个核苷酸位置上存在转换等变异引起的基因多态性研究[1,4-10,12-16,18,20-21,26,28-32]。主要研究技术有聚合酶链式反应（PCR）、聚合酶链-限制性片段长度多态性（Polymerase chain restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、飞行时间质谱技术（Time-of-flight mass spectrometry，TOF-MS）、等位基因特异性探针（如Taqman探针）以及高通量、灵敏度好、特异性高的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（Matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）等方法，加之运用相对风险分析（Haplotype relative risk，HHRR）和传递不平衡（Transmission disequilibrium test，TDT）追溯父母组与病例组的遗传关系。研究涵盖血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）基因DD 型、内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因G894T 变异、细胞色素P2C19（CytochromeP 2C19，CYP2C19*2）基因多态性、血管性血友病因子（Von willebrand factor，vWF）基因M-M-型、凝血因子Ⅶ（Coagulation factor Ⅶ，FⅦ）基因M1/M1 型、血浆纤维蛋白原Bβ（FibrinogenBβ，FgBβ）基因C/T 多态性、载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）基因E3/E4 多态性、ATP 结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）基 因R219K 多 态 性、白 细 胞 介 素-8（Interleukin-8，IL-8）基因A/T 多态性、亚甲基四氢叶酸 还 原 酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因C677T 多态性、基质金属蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase-3，MMP-3）基因5A/5A 多态性等，以上基因的多态性均与冠心病血瘀证具有相关性。

2.2 差异基因的表达

共有8 篇分析差异基因表达信息的研究[2-3,11,17,22-25]，主要采用mRNA 差异显示，cDNA 微阵列，实时荧光定量RT-PCR 对待测样品进行定量分析，或用Affymetrix 基因芯片进行杂交测序等技术研究细胞编码基因的调控规律，以阐明生物体在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA 及其功能。已有多个研究发现冠心病血瘀证患者的基因表达程度与健康对照组存在一定程度的差异，从得到的差异基因表达的功能可以看出，它们从不同途径导致和参与了冠心病血瘀证内皮损伤、细胞凋亡、血小板聚集、血液高凝态、脂代谢、胆固醇转运、炎症反应、免疫反应、血管平滑肌增殖过程。

2.3 基因的甲基化修饰

结合血瘀证病理机制以及参考基因启动子CpG岛的注释情况，选择性检测甲基化水平是目前血证DNA 甲基化的主要研究方法，DNA 的甲基化修饰属于表观基因组学范畴，指通过DNA 甲基转移酶（DNA methylation transferase，DNMT）的作用，在5′-CpG-3′的第5个碳原子上合成甲基。目前多采用重亚硫酸盐测序方法（Bisufite sequence PCR，BSP）、甲基化特异性PCR（MS-PCR）技术或Infinium Human Methylation450 BeadArray 高通量芯片等技术进行检测，最终根据CpGs 的甲基化或非甲基化DNA 状态，确立发生甲基化DNA 的分子以及与基因转录的作用。对于冠心病血瘀证这一冠心病中最重要的证型，甲基化起到了重要的作用[19,25,27,33-34]，包括影响血管平滑肌增殖的Kruppel 样 因 子5（Kruppel-like factor 5，KLF5）、LRP12、ER-α和AGTRAP 基因甲基化水平，影响脂代谢水平的DES、CTNNB1、ZEB2 基因甲基化水平，影响血小板聚集的Gp6 基因甲基化，影响炎症反应的IL-6基因-1118 bp至-826 bp的CpG位点甲基化等。

3 涉及的生物学功能

3.1 血管内皮损伤

多项围绕血管内皮损伤的研究均与ACE 基因多态性有关[1,4-7,10,12]，ACE 基因DD 型为早发冠心病（男性≤55，女性≤65）血瘀证发病的易感基因[7]，与遗传因素无关[5]，可能通过调控人体血管内皮功能而影响冠心病（Coronary heart disease，CHD）临床表现的形成，导致血管紧张素Ⅱ（AgⅡ）、内皮素/一氧化氮（ET/NO）水平上升[1,4]，且其表达显著高于非冠心病血瘀证的患者，这提示了此基因型可能为冠心病血瘀证的特异基因，而并非只与血瘀证证候有关[4]。DD 型患者存在多支冠脉病变的概率较大，病情较为严重[6]，植入支架数更多[12]，除此之外，ACE 的外显子17 基因片段rs4343（G2350A）多态性也可能是早发冠心病的危险因素之一[10]。eNOS 于血管内产生一氧化氮及协助调节血管功能，有研究运用TOF-MS技术发现eNOS基因G894T型是早发冠心病发病的危险因素之一[8]，这与李建军[6]运用PCR 得出的结论相矛盾，可能与基因组技术的不同有关。香丹注射液能调节eNOS 和内皮素ET-1的mRNA表达，从而改善冠心病血瘀证患者血管内皮功能[2]。复方丹参滴丸可通过使细胞凋亡相关基因BCLF1 mRNA、Bax mRNA 表达显著减弱，抑制血管内皮反应引起的损伤，对冠心病血瘀证发挥治疗保护作用[11]。另有研究表明，作用于血管内皮、引起内皮损伤 的SLAMF1、CABARA1、ZNF350 基 因[3]及FGF2 基因[24]在冠心病血瘀证组显著表达。虽然研究表明MEF2A 基因是冠心病的致病基因[35]，研究发现其多态性并不是冠心病血瘀证型的易感基因位点，但受限于纳入研究的数量，尚不能得出肯定结论[9]。

3.2 血液流变学改变

冠心病血瘀证血液流变学的改变在基因层面均有体现[13-21]，研究发现冠心病血瘀证与凝血因子Ⅶ（FⅦc）M1/M1 基因型具有相关性[13]，M1/M2 多态性也与冠心病血瘀证存在关联，但与疾病基因座不存在连锁，不是遗传易患基因[16]。Taqman 探针检测发现血小板膜糖蛋白GPⅡb-Ⅲa 多态性不是冠心病血瘀证的敏感指标，但冠心病血瘀证组的GPⅡb-Ⅲa 活性水平存在显著性差异，所以并不排除编码血小板膜糖蛋白的基因中存在其他可能影响其活性表达的多态位点[14]。在临床疗效方面，给予含有至少一个GPⅡb 突变型基因C 的冠心病血瘀证患者血府逐瘀口服液后，发现比AA 型患者在红细胞变形指数、血瘀证计分有明显差异，血液流变学方面疗效更好，但由于纳入患者例数较少，结论仍需检验[15]。从预后而言，PCI 术后重度血瘀证患者更易出现CYP2C19*2 基因（GA+AA）突变[18]，随后更有研究统计发现GA基因型其支架内血栓形成、心肌梗死等不良反应的出现较AA型多[21]。另有研究表明血管性血友病因子vWF 基因M-M-基因多态性可促进血小板黏附形成血栓，纤维蛋白原Bβ链FgBβ基因启动区多态性可升高Fg 而使血液处于血栓前高凝状态，影响血管壁的切流速度，加速冠心病血瘀证的血栓形成[20]。GP6 基因在焦磷酸测序的实验中显示其甲基化水平显著升高，尤其在早发冠心病血瘀证患者的外周血液当中，提示其甲基化状态可能和早发冠心病血瘀证的发生具有相关性[19]。有研究者根据瓜蒌薤白半夏汤治疗前后血液黏度的结果，设计制备了“病证结合”“以药测证”芯片，在两张芯片中筛选出了共同差异表达的血液流变学的4个相关基因[17]。

3.3 炎症反应与免疫调节

白细胞介素是一种重要的炎性细胞趋化因子，其多态性在冠心病中发挥重要角色[36]，IL-8 基因-251 区的AT 基因型被认为可增加家族聚集性冠心病血瘀证的易感性[26]。白细胞介素基因的甲基化程度也影响着冠心病血瘀证的形成，已有研究表明血瘀证患者IL-6转录起始位点前-1118 bp 至-826 bp 序列中7 个位点CpG 位点甲基化程度高于非血瘀证组，但差异尚不明显[27]。另有多个研究均表明IL-8 或IL-6 基因的差异表达水平均在冠心病血瘀证组上调，进而介导炎症反应[22,24-25]。除炎症反应外，免疫调节在冠心病血瘀证患者中差异表达，有研究通过基因芯片分析冠心病血瘀证患者的外周血白细胞，得到48 个差异基因，富集了10条通路，其中有5个涉及炎症和免疫反应，说明了免疫反应介导血瘀证的发生发展的比例和显著性优势[22]。另有研究发现，免疫相关蛋白激酶Cβ1（PKCβ1）、免疫球蛋白IgG 结晶片段受体ⅢA（FcγRⅢA）的mRNA 表达在冠心病血瘀证患者中也均有显著差异[23]。

3.4 血管平滑肌增殖

有研究运用焦硫酸测序技术检测发现α雌激素受体（Estrogen Receptor-α，ER-α）、AGTRAP 基因启动子区域的甲基化状态与冠心病血瘀证血管平滑肌增殖密切相关[19]，可能通过调节血管平滑肌（Vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖影响动脉粥样硬化的发展，同理运用MS-PCR 发现冠心病血瘀证患者的KLF5、低密度脂蛋白相关蛋白12（Low density lipoproteinrelated protein12，LRP12）基因启动子的甲基化水平较健康人低[25]。MMP-3-1171 区的5A/6A 基因型及5A 等位基因可使血管平滑肌细胞凋亡进而影响动脉粥样硬化斑块的形成和稳定，从一定角度揭示了增加血瘀证发生风险的原因[29]。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）作为血同型半胱氨酸Hcy 代谢途径中的一种关键酶[37]，其活性降低可引起Hcy 水平升高，刺激血管平滑肌细胞增生，最终导致动脉粥样硬化，增加冠心病的发生风险。研究发现MTHFR 基因C677T 多态性与胸痹心血瘀阻证和血Hcy 水平均有相关性，可导致MTHFR 活性降低，且CC 基因型更倾向于在心血瘀阻证中表达[30]。G 蛋白β3 亚单位基因（GNB3）介导许多刺激血管增生效应，细胞外血管活性多肽、生长因子均通过激活血管平滑肌细胞膜上的G 蛋白，控制血管平滑肌细胞的舒缩、合成、分泌、分化、迁移和增生等功能。研究表明，GNB3基因825T等位基因携带不仅是诱发冠心病血瘀证的因素之一，而且可能提示预后不良，体现为加减血府逐瘀汤对GNB3基因825T等位基因携带人群疗效较差[28]。

3.5 血脂水平

许多基因可通过影响血脂水平进而与冠心病相关。载脂蛋白E（ApoE）有E2、E3、E4 三种主要的异构体，分别受ε2、ε3、ε4 三个等位基因编码，研究发现ApoE 的E3/E4 基因型和ε4 等位基因与冠心病血瘀证有相关性，且可影响血脂水平[31]。ATP 结合盒转运子ABCA1 在胆固醇从周围细胞流出和HDL 生成的起始步骤中起着重要的作用，被认为是HDL-C代谢的限速因子，李杰等利用MALDI-TOF-MS 技术发现ABCA1基因219位点的R219K多态性在早发冠心病和健康人群差异有显著性[32]。补体系统C3、基质金属蛋白MMP-9 基因的表达也可通过影响血脂与家系冠心病血瘀证斑块形成相关[24]。另有研究运用高通量芯片技术检测发现DES、CTNNB1、ZEB2 基因的甲基化修饰可能是冠心病血瘀证的易感危险因素，且具有上述基因甲基化的患者血脂水平较高，加减养心通脉方对冠心病血瘀证DES、CTNNB1、ZEB2 三个易感基因甲基化的修饰及对血脂水平均有调控作用[33-34]。

4 讨论

4.1 冠心病血瘀证基因组学的研究思路

根据纳入文献的一般情况特征，可总结冠心病血瘀证基因组学的研究思路包括：临床选择一定数量的冠心病血瘀证患者作为试验组并设置合理的对照组，随后根据基因多态性、差异基因表达、基因甲基化修饰3 个基因组学研究类型的不同，运用PCR 技术、TOF-MS技术、Taqman探针、Affymetrix 基因芯片、重亚硫酸盐纯化等基因组学检测方法，进行冠心病血瘀证相关基因的筛查和验证，寻找差异基因片段并进行生物信息学分析，研究基因组结构及基因之间相互作用，探讨其与冠心病血瘀证病理改变的相关性（图1）。在上述研究思路的基础上运用活血化瘀中药进行干预治疗，可明晰方药对冠心病血瘀证发挥治疗保护作用的基因组学机制，辨析方药对何种基因型的冠心病血瘀证患者疗效较好。

4.2 冠心病血瘀证生物学功能及调控基因总结

冠心病血瘀证是血液及其循环系统形态与功能异常的综合体现，主要与血管内皮损伤、微循环异常和炎症反应等有关。其中血管内皮损伤主要与ACE、eNOS 以及ET-1、BCLF1、Bax、SLAMF1 凋亡类基因的表达有关；血液流变学改变与FⅦc、FgBβ凝血类基因的表达，GPⅡb-Ⅲa、CYP2C19*2、vWF 血小板相关基因的表达，GP6 基因的甲基化状态有关；IL-8 基因多态性、IL-6 甲基化程度在冠心病血瘀证患者的炎症反应中也均有显著差异，PKCβ1、FcγRⅢA的mRNA 表达均介导了冠心病血瘀证的免疫反应；ER-α、AGTRAP、KLF5、LRP12 甲基化状态，MMP-3、MTHFR、GNB3 基因多态性均可调节血管平滑肌（VSMC）的增殖影响冠心病血瘀证动脉粥样硬化的发展；ApoE、ABCA1 多态性，补体C3、MMP-9 基因的表达，DES、CTNNB1、ZEB2基因的甲基化修饰均对冠心病血瘀证患者的血脂水平有特异性调控作用。

4.3 不足与展望

图1 冠心病血瘀证基因组学的研究思路

冠心病血瘀证在基因多态性、差异基因表达、基因甲基化修饰方面均有较多研究，本系统综述归纳了冠心病血瘀证研究所涉及的基因组学技术、生物学过程及相应的代表基因。追溯原始文献发现，使用基因芯片测序的样本量普遍较少，其准确性仍需检验，虽然研究中纳入患者的基础条件不完全相同，但基线大致相平，具有可比性。展望未来，考虑到冠心病血瘀证的病理学表现并不是单个基因错误表达的结果，而是由多基因调控网络紊乱导致的生物学功能改变，一个基因的上调或下调会影响上下游基因的表达状态，因此要求我们对已有文献支撑的多个基因进行综合性的、网络性的“联合基因型分析”工作。可对文献中的相关基因运用CYTOSCAPE 进行网络构建，MCODE进行模块划分后再对重要模块进行功能与通路分析[38]。例如两个基因是各自模块的重要组成基因，同时又联系于其他模块，并与外部模块的通路、基因或功能相关联，该研究方法既体现了冠心病血瘀证基因的整体特点，又关注了基因网络的局部差异，探索冠心病血瘀证不同亚型的特异基因或成为未来冠心病血瘀证基因组学深入研究的方向，可为冠心病“病证结合”的预防与治疗提供新的思路。

附录

知网：SU =（‘冠心病’+‘胸痹’）*（‘血瘀证’+‘活血化瘀’）*（‘基因’+‘多态性’）187

万方：题名或关键词:(冠心病+胸痹)*题名或关键词:（血瘀证+活血化瘀）*题名或关键词:（基因+多态性）106

Medline: 12

Cochrane Central Register of Controlled Trials: 30

续表