冠心病血瘀证免疫炎症机制研究撷要＊

王靖怡，李 军，陈恒文，刘咏梅，潘菊华，王 阶

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

冠状动脉粥样硬化性心脏病是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄、痉挛或阻塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病，统称为冠状动脉性心脏病或冠状动脉疾病，是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型。免疫炎症机制在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要作用[1]，近年来已成为研究聚焦热点之一[2，3]。中医认为冠心病属“胸痹心痛”范畴，多以血行不畅、心血瘀阻为其主要病机[4]。一项冠心病现代中医证候特征临床流行病学调查显示，血瘀证为冠心病患者最常见的证候要素，占比高达77.89%[5]。冠心病血瘀证患者免疫功能往往易呈现紊乱状态[4]。因此，从免疫炎症角度入手对冠心病血瘀证进行研究，有助于扩展冠心病血瘀证证候内涵及实质，充分发挥活血化瘀药物的临床疗效。

1 冠心病血瘀证免疫炎症多组学研究成果

2000年以后，冠心病血瘀证研究重点逐步转向多组学研究，涉及基因组学、表观遗传学、蛋白组学、转录组学等方向[6]。这些由组学构建起的多靶点网络，可以基于病证本身复杂性，从而更全面地构建冠心病血瘀证证候的潜在分子网络机制。这也是在早期单纯观察炎症或免疫反应相关指标变化的基础上，进一步挖掘其背后的直接分子机制，做到“知其然更要知其所以然”。

基因组学（Genomics）是用于绘制生物体内所有基因、分析核苷酸序列、进行基因定位及功能注释分析的新兴学科。一些学者利用基因组学方法从分子水平对冠心病血瘀证证候实质进行探索，发现免疫炎症反应在冠心病血瘀证中具有重要地位。一项基于基因组学开展、运用差异显示方法研究冠心病血瘀证患者外周血白细胞mRNA 的研究显示，研究中所获得的3 条（b13、49b、23b）与人类基因100%同源基因中，显著高表达的b13 表达于T 淋巴细胞及B 淋巴细胞表面，是淋巴细胞激活信号分子家族成员1（SLAMF1），主要参与炎症反应[7]。另有研究者利用基因芯片技术，对家系冠心病血瘀证和家系冠心病非血瘀证患者进行差异基因表达谱构建，发现家系冠心病血瘀证相关差异基因共有8 个（其中上调4 个，下调4 个），结合KEGG 通路分析发现差异主要涉及免疫炎症过程相关的白细胞介素、补体系统、内皮细胞黏附因子等[8]。

表观遗传学（Epigenetics）目前是心血管领域的研究热点，可用于解释基因与环境间的交互作用。从该角度探讨冠心病血瘀证实质主要包括非编码RNA 调控和DNA 甲基化修饰。研究发现miRNA 在冠心病血瘀证免疫炎症过程中发挥作用，在不稳定型心绞痛血瘀 证 患 者 中，miR-146b-5p 和miR-199a-5p，以 及CALR 和TP53 均可以作为潜在的生物标记物参与减轻炎症反应和调控凋亡的病理机制[9]。相关研究表明，同样作为非编码RNA 的某些特定lncRNA 的表达水平变化与冠心病血瘀证免疫炎症通路密切相关，如冠心病血瘀证lncRNA 调控网络中的关键节点CTA-384D8.35、CTB-114C7.4、RP11-567M16.6 和has-miR-3158-3p，都与免疫炎症相关[10]。亦有研究者利用高通量芯片技术，通过筛选CHD 血瘀证、瘀毒轻证、瘀毒重证及健康对照组差异miRNA 和lncRNA，并进行功能学分析，发现差异miRNA 参与免疫炎症反应过程，差异lncRNA 与炎症及免疫等生物学过程相关，提示miRNA及lncRNA均参与了CHD血瘀证的免疫炎症反应[11]。中医证候与DNA 甲基化关系密切[12]，在冠心病血瘀证甲基化相关研究中也发现，通过对CHD 不稳定型心绞痛血瘀组和非血瘀组患者外周血细胞中白细胞介素-6（IL-6）基因启动子区甲基化状态进行分析，发现血瘀证组患者IL-6水平高于非血瘀组[13]。

2 多种免疫炎症反应环节参与冠心病血瘀证

除上述多组学研究中涉及的分子（包括DNA 和非编码RNA）及其相关修饰机制外，免疫炎症反应过程中的诸多环节亦会参与到冠心病血瘀证中，具体涉及免疫细胞、炎症因子及生物标志物、免疫炎症相关信号通路等不同方向。

2.1 免疫细胞

冠心病是一种以动脉粥样硬化为基础，脂质聚集、免疫细胞浸润和纤维脂肪斑块形成为特征的炎症过程[14]，相关免疫细胞通过关联机制参与其形成过程。沉积的脂质通常被认为是炎性反应初始触发信号[15]，通过募集使单核细胞分化成为巨噬细胞，进而吞噬氧化的脂质形成泡沫细胞，分泌相关细胞因子及趋化因子，促进免疫（淋巴）细胞的浸润与活化。淋巴细胞在炎症免疫过程中的作用不同，T 细胞介导机体适应性细胞免疫，B细胞产生特异性抗体发挥体液免疫作用，自然杀伤（NK）细胞在固有免疫应答中发挥重要作用，可直接杀伤某些细胞，上述3种细胞亚群构成淋巴细胞亚群，其水平失衡与血瘀证关系密切，尤以T细胞亚群为关注热点[16，17]。根据T 细胞表达不同，可分为CD4+T 细胞和CD8+T 细胞，二者因各自所分泌不同的细胞因子而具备不同的免疫功能。正常情况下，CD4+T 细胞、CD8+T 细胞以及CD4+T/CD8+T 比值处于正常范围内，相互反馈调节并维持动态平衡状态，而其数量及比值的改变往往用来表示机体免疫功能的变化[18，19]。一项早期的冠心病血瘀证研究中显示，冠心病血瘀证患者的CD4+T 细胞水平降低，CD8+T 细胞水平高于正常人，二者比值下降，提示患者免疫功能降低[20]。

网络驱动综合分析显示B细胞免疫应答是冠心病（CHD）的致病因素[21]。B 细胞受到抗原刺激后会增殖分化形成浆细胞，后者可合成、分泌抗体，发挥免疫防御、稳定和监视等功能。随着研究的不断深入，研究者们逐渐认识到B细胞多种亚型可在动脉粥样硬化中发挥特定作用，其分泌的特异性IgM 抗体对CHD 有保护作用且不依赖补体系统[22]，B 细胞特定亚型可通过CD4+T 细胞相关机制促进动脉粥样硬化[23]，调节性B细胞可以通过产生白介素-10（IL-10）、白介素-12（IL-12）或转化生长因子-b（TGF-b）等，与致病性T 细胞作用，发挥调节免疫应答的功能，对动脉粥样硬化的形成与发展发挥重要作用[24，25]。此外，冠心病血瘀证患者存在明显的B 细胞比例失调，低水平B10 细胞与冠心病血瘀证密切相关[26]。

2.2 经典炎症因子及生物标志物

2.2.1 CRP/hs-CRP与ICAM-1

CRP 是由肝细胞产生的急性时相蛋白，作为一种敏感的非特异性炎症标志物，可以直接发挥促炎效应，介导和刺激相关炎性因子的释放与表达[27]，其与冠心病的关系已得到较为广泛的认证，因此一般作为经典的炎症因子观察指标。目前CRP 已成为冠心病发病的独立危险因素及较敏感的预测因子，这在一定程度上也反映了冠心病发生、发展及预后进程中炎症反应的重要作用。有相关研究[28]通过对比冠心病血瘀证患者及正常对照组hs-CRP 水平，发现冠心病血瘀证组hs-CRP 明显高于健康对照组，认为hs-CRP 可作为较灵敏的慢性炎症标志物，用于评价冠心病血瘀证病理过程，指导临床治疗，判断预后疗效等，也为冠心病血瘀证诊疗客观化提供了重要依据。另有研究[29]基于CRP 可上调细胞间粘附因子（ICAM-1）表达，从而促进动脉壁内多种细胞和循环中单核细胞分泌炎症因子的作用，发现冠心病血瘀证患者血清hs-CRP 及ICAM-1 水平均明显高于正常对照人群，认为二者与冠心病血瘀证及炎症反应存在着一定的关联。

2.2.2 IL-8、IL-6

IL-8 作为经典的炎症趋化因子，无论从基因还是蛋白质水平均可检测到IL-8 存在于冠状动脉粥样硬化血管损伤处，其在动脉粥样硬化发生及进展的各个阶段均发挥重要作用[30]。有研究发现冠心病血瘀证差异基因IL-8具有激活血小板的作用，在一定程度上影响血小板黏附、聚集及释放功能[31]。在此基础上，有研究发现冠心病血瘀证患者血清IL-8水平明显升高，并揭示其参与冠心病血瘀证形成的可能机制包括：①通过活化粘附分子MAC-1促进白细胞与血小板聚集；②诱导血小板与中性粒细胞、单核细胞聚集并促进表达具有促凝活性的组织因子；③可通过与血小板上受体CXCR1 结合直接诱导血小板活化[32]。IL-6 与心血管事件的危险性相关，患者血浆IL-6水平每上升一个四分位数，发生心肌梗死的危险性将升高38%。有研究显示，IL-6 在CHD 血瘀证患者与非CHD 组患者之间存在显著差异，通过神经网络分析发现IL-6对血瘀证影响较大[32]。

2.2.3 TNF-α、IFN-γ

TNF-α作为一种兼具多种生物功能的促炎细胞因子，由巨噬细胞和脂肪细胞产生。其可活化内皮细胞进而促进炎症细胞的聚集和动脉粥样硬化的形成，具体过程为斑块内巨噬细胞分泌的TNF-α对内皮细胞具有直接毒性，从而引起炎症反应进一步损伤血管内皮，并可上调粘附分子，形成更多的巨噬细胞并产生更多的TNF-α，这种循环结果可促进稳定型斑块向不稳定型斑块转化[33，34]。相关研究显示冠心病血瘀证患者采用加味血府逐瘀汤治疗前后TNF-α等炎症因子下降程度明显，体现了活血化瘀中药具有一定的抗炎作用[35]。IFN-γ本身作为一种致炎性细胞因子，也可以介导免疫炎症的发生，可以由Th1 细胞、单核-巨噬细胞、NK 细胞等多种细胞合成及分泌，既可以直接发挥致炎作用，活化内皮细胞，加重血管内皮损害，也可间接通过激活巨噬细胞等，促进IL-6、TNF-α等其他炎症因子的产生，进而促使动脉粥样硬化形成，其作用的发挥往往可通过多个信号通路实现[36，37]。有研究[38]显示，冠心病心绞痛患者与健康对照组相比，IFNγ水平明显升高，而不稳定型心绞痛IFN-γ水平则明显高于稳定型心绞痛，提示IFN-γ与冠心病及其严重程度关系密切。在此基础上发现，冠心病血瘀证患者IFN-γ较非血瘀证患者明显升高，且二者呈正相关趋势，表明冠心病血瘀证与IFN-γ存在一定的相关性。

2.2.4 其他

一项对冠心病血瘀证遗传相关差异基因筛选及功能路径分析研究显示，家系冠心病血瘀证患者差异基因表达主要涉及6 类基因系表达改变，主要以炎症因子为主（具体包括趋化因子家族、白介素细胞因子和补体等）。此外，基质金属蛋白酶系（MMPs）中表达上调的MMP-9 主要参与白细胞跨内皮迁移，影响炎症免疫系统[39]。补体IgG、IgA、IgM 的水平异常也可提示冠心病血瘀证患者体内免疫功能可能处于紊乱状态，炎症反应可能较为剧烈。

2.3 免疫炎症相关信号通路

尽管信号通路以研究机体调控网络为主，探究生物分子间的相互作用及传递规律，但其中蕴含的整体观念与中医学证候复杂性的特点不谋而合[40]。早期研究通过对冠心病血瘀证和非冠心病血瘀证患者的差异基因进行筛选，将其交集视为血瘀证相关差异基因，发现与炎症免疫相关的基因有5 个，5 条信号通路涉及炎症免疫反应，由此推论炎症及免疫反应可以在某种程度上介导和参与血瘀证的发生发展过程[41，42]。

现代医学认为，核因子-κB（NF-κB）可以通过调控众多靶基因的转录及表达，从而在炎症反应及免疫应答等诸多生理过程中间环节发挥重要作用。有研究显示冠心病不稳定型心绞痛血瘀证患者外周血CD14+单核细胞中Toll 样受体-2、Toll 样受体-4、NFκB 表达明显高于冠心病不稳定型心绞痛非血瘀证患者，采用丹参酮IIA 磺酸钠注射液进行治疗后，可能通过抑制TLRs/MyD88/NF-κB 信号通路，发挥抑制炎症因子释放、稳定斑块及缓解心绞痛等作用[43]。在冠心病血瘀证DNA 甲基化研究中发现，miR194 promoter/miR194/MAPK 信号通路是整个DNA 甲基化-miRNAmRNA 调控网络中的关键节点，该调控轴与免疫炎症反应相关，通过临床试验验证发现，血瘀证改善后，该关键节点也随之发生变化[44]。

2.4 其他

最早有相关临床研究基于红细胞免疫功能改变，并应用冠心II 号方进行干预，以探讨冠心病血瘀证免疫学实质。红细胞具有免疫粘附功能，其表面存在免疫粘附受体（补体C3b 受体）可以吸附抗原-抗体所形成的免疫复合物，并在血循环中经肝脏网状内皮系统清除。该过程可以使C3b 降解失活变性，并主要集中在血管中央血流部位，有效减少免疫复合物沉积与内皮细胞直接接触所导致的炎症反应。研究结果显示，冠心病血瘀证确实存在红细胞免疫功能改变，其RBC-C3b受体花环率显著高于正常对照组，而经过冠心II 号方治疗后，除心绞痛症状改善、血瘀体征减轻或消失等，其RBC-C3b 受体花环率也随之下降，考虑冠心II 号方可能通过改善红细胞受体免疫粘附活性，调节其免疫功能，进而达到控制心绞痛症状发作、改善心肌功能的作用[45]。

3 活血化瘀中药发挥调节免疫及抗炎作用

已有血瘀证相关研究多围绕“血”与“脉”两方面开展，涉及血流动力学、血液流变学、血小板形态功能、血管内皮细胞、微循环等内容[46-48]。早在1974年，天津南开医院首次通过观察活血化瘀药对几种不同实验性炎症过程的影响，证实这些药物具有抗炎功效[49]。这可以视为血瘀证与免疫炎症关联认识的初步尝试。此后一段时间内，血瘀证与炎症免疫反应的相关性研究多围绕活血化瘀药与炎性疾病开展。直至2007年，相关学者发现并正式提出，动物及临床研究中，血瘀证与炎症之间的关系密切，炎症免疫反应可以从特定角度对血瘀证实质进行揭示[50]，这也使血瘀证与炎症免疫反应的相关性得到关注，并为后续研究提供了基础和方向。

针对血瘀证，中医多采用活血化瘀药物进行对证治疗。大量临床观察及基础研究显示活血化瘀药物可以通过调节血流动力学、改善血管管壁通透性、调整促炎及抗炎细胞因子等方面，综合发挥抗炎免疫调节功用。丹参、川芎、赤芍等活血化瘀常用中药可以从多种途径[51，52]发挥作用，具体包括：①促使血流加速；②增加毛细血管网开放，并提高其张力；③改善微循环；④增强组织耐受缺氧及抗损伤的能力；⑤有效增加冠状动脉流量；⑥通过调节NO/ET 平衡调节血管通透性；⑦通过抑制促炎因子（如CRP、TNF-α等）或促进抗炎因子（如IL-10等）表达从而综合抗炎。围绕冠心病血瘀证已先后开展多项活血化瘀疗法的临床研究，结果表明，以活血化瘀为组方原则，应用活血化瘀中药进行治疗，可以明显改善冠心病心绞痛相关症状、缓解缺血、抑制炎症反应，从而有效提高患者的生活质量[6]。有文献指出，在冠心病患者血液中存在多种导致动脉硬化的抗体，而活血化瘀药物不仅可以通过调整机体细胞免疫及淋巴免疫的功能而促进瘀血消散，而且可以通过减少炎症因子的表达、抑制机体免疫作用等，从而降低内皮细胞通透性[53，54]。

以三七总皂苷为主要成分的血塞通软胶囊，具有活血化瘀、通络止痛之功效，可用于冠心病血瘀证治疗中，不仅能有效改善患者心肌缺血症状及血流动力学指标，还可发挥调节免疫、抗炎，延缓动脉硬化的作用，从而保护损伤的血管内皮，其发挥作用可能与调控hsa-miR-199a-5b 和hsa-miR-146b-5p 及他们所调控的抗原递呈通路存在一定的关系[55，56]。临床试验表明，均具活血化瘀功效的丹参及川芎合用可以增强药效，据此研发的丹参川芎嗪注射液在临床疗效观察中显示，可以通过抑制炎症反应，延缓动脉斑块形成，增加冠脉的血流量，从而改善患者的临床相关症状[57]。同样具有活血化瘀、通络止痛功效的银丹通络胶囊是由丹酚酸、三七总皂苷及银杏提取物组成，主要应用于冠心病血瘀内阻证患者。一项基于90 例冠心病不稳定型心绞痛血瘀证患者的随机对照临床研究表明，银丹通络胶囊干预后患者血浆纤溶酶原激活剂抑制物（Plasminogen activator inhibitor，PAI）水平显著下降，而该指标与C 反应蛋白相关，明确了该药在改善患者临床症状的同时，可以有效降低炎症因子及相关标志物水平，提示其具有抗炎作用[58，59]。

4 小结

早期研究发现，冠心病血瘀证患者免疫炎症临床相关生物标志物表达水平存在差异，以此为切入点，研究者们试图说明冠心病血瘀证与免疫炎症过程存在相关性。然而，相关性只是因果逻辑关系的前提，若要进一步探寻冠心病血瘀证在免疫炎症方面的具体机制，则需深入到细胞乃至分子水平。基于当前多组学技术、系统生物学及生物信息技术的发展，冠心病血瘀证研究层面已深入到DNA、RNA 及蛋白水平。尽管如此，由于免疫炎症反应本身具有复杂性，免疫及炎症相关信号在传递和发挥作用的过程中往往涉及多种免疫细胞和炎症因子，机制表型层级嵌套丰富，不同研究层次之间往往同时存在关联、交互与重叠，这些均会对全面清晰地阐述冠心病血瘀证的免疫炎症机制造成一定的困难。当前，多数研究也仅从免疫炎症中的某个单一角度对冠心病血瘀证机制进行探索，尚缺乏深入系统囊括免疫炎症多重机制及环节的网络研究，这也是构建冠心病血瘀证免疫炎症完整机制的必要前提。在未来的研究中，我们可以先从间接机制入手，利用高通量测序及芯片等技术，对冠心病血瘀证患者使用中药干预前后发生变化的免疫炎症相关通路进行富集分析，并利用生物信息学多种在线数据库及预测工具平台，对可能涉及的免疫及炎症分子进行预测，并利用成熟的技术手段实现通量降维，验证并确定参与免疫炎症过程的关键调控分子，从而筛选并构建冠心病血瘀证相关的免疫炎症通路及生物标记物，最后再回溯到临床进行转化。

从发现冠心病血瘀证与免疫炎症反应存在相关性，到二者间深层机制的探寻，我们经历了“知其然”到“知其所以然”的过程。以中医药理论为指导，结合现代分子生物学等技术，是冠心病血瘀证实质研究的基础，免疫炎症作为其实质研究的一个分支，也受到了越来越多的关注。相信随着技术的不断发展，知识的不断更新及新兴科研方法的不断建立，冠心病血瘀证在免疫炎症层面的具体机制会逐渐清晰，结合活血化瘀中药相关药理作用，二者之间形成互相印证的闭环，这也有助于回答活血化瘀中药为何能在冠心病血瘀证临床治疗过程中发挥疗效。