FSH通过AKT/FOXO1通路调控绵羊卵泡颗粒细胞增殖的研究

刘春洁 王兆琛 杜 炜 赵勇超 张家新

(内蒙古农业大学 动物科学学院/内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，呼和浩特 010018)

哺乳动物卵泡发育过程中，超过99%的卵泡会发生闭锁，卵泡闭锁是卵巢卵泡发育、成熟、排卵过程中重要的生理过程。如果这一过程不能正常进行，往往会导致雌性动物多囊卵巢综合征和卵巢早衰，甚至不孕不育[1-2]。已有研究表明卵泡闭锁与GCs凋亡密切相关，主要体现DNA碎片化和促凋亡基因表达显著上调[3]。卵泡发育是一个相对复杂的过程，主要受促性腺激素的调控[2,4]。其中促卵泡素(FSH)作为卵泡生长、发育和优势卵泡选择的一种重要的促性腺激素，同时还具有促进GCs增殖分化的功能[5-7]。这一过程是通过激活GCs的多个信号级联引起FSH生理机制应答，包括蛋白激酶A(PKA)，蛋白激酶B(PKB/AKT)，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)和细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)[8]。

在小鼠细胞研究中发现，通过减缓FOXO1转录抑制可以影响细胞中细胞周期蛋白(Ccnd-2)的表达[9]。研究发现敲除小鼠Ccnd-2基因后，细胞增殖被阻滞[9]。FOXO1的转录抑制也可以影响细胞核抗原(PCNA)基因的表达，PCNA是一种与增殖相关蛋白DNA合成有关的基因，起初表达于初级卵泡的GCs，在FSH作用下其表达量增加[10-11]。Bcl-2作为抗细胞凋亡家族蛋白，定位于线粒体膜，参与GCs的凋亡，其作用机制同样受到FOXO1转录调控[12]。FOXO1基因具有调节细胞凋亡，细胞周期停滞，细胞稳态等功能[9]。由于FOXO1结合DNA，抑制或激活靶基因特异性转录[13]。而FOXO1结合DNA能力主要受AKT磷酸化作用，当未发生磷酸化时，FOXO1定位于细胞核，通过与其靶基因结合到FOXO1识别元件(FRE)上，发挥生物学活性[13-14]。

FOXO1是FSH信号通路的靶分子，受FSH的负调控。FSH通过PKB/AKT通路引起FOXO1的磷酸化失活，从而失去对靶基因的转录调节作用[15]。因此，FSH维持卵泡生长发育的功能可能与FSH对FOXO1的抑制有关。其在GCs上发挥的潜在机制仍有待进一步探究。关于FSH通过AKT/FOXO1通路调控卵泡颗粒细胞增殖的研究大多数是针对小鼠等试验动物，在家畜上研究较少，因此，本试验拟用绵羊卵巢GCs，对绵羊GCs用不同浓度FSH处理后，利用CCK-8法检测细胞活性，AnnexinV-FITC测定细胞凋亡和细胞周期变化，Western-Blot检测p-AKT和p-FOXO1蛋白质表达；qPCR分析PCNA、CCnd-2和Bcl-2基因表达量变化，以期探究FSH通过AKT/FOXO1信号通路对绵羊GCs的调节作用，为提高母畜繁殖性能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本地屠宰场获得绵羊(24～36 月龄，体重平均83 kg)卵巢，去掉系膜等残余组织，使用37 ℃生理盐水洗涤3次，置含有预热37 ℃生理盐水保温杯内，并于2～3 h内送至实验室，然后再预热37 ℃，添加青链霉素合剂的生理盐水洗涤卵巢3遍，将卵巢放于预热的灭菌生理盐水，置37 ℃水浴锅，待用。

1.2 试验试剂

促卵泡激素FSH(Bioniche，加拿大)； DMEM/F 12培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(HyClone，美国)；电转液购自(Biosharp，中国)；0.45 μm PVDF膜(Millipore，美国)；AKT 磷酸化抗体、FOXO1磷酸化抗体、β-actin抗体、AKT抑制剂AT7867(MCE，美国)；HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG、蛋白Marker、ECL底物液、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，美国)；Annexin-FITC/PI(Vazyme，美国)；CCK-8(Beyotime Biotechnology，中国)。

1.3 试验方法

1.3.1GCs收集

在超净台内用眼科剪将卵巢上的卵泡小心分离，用PBS尽可能将卵泡周围的组织清洗干净。收集直径4～6 mm大小卵泡。在盛有PBS的凹形皿内，用眼科剪将卵泡轻轻剪开，用刮刀沿卵泡内壁适度刮取细胞，置于含青霉素链霉素的PBS液中，并清洗3次，然后用添加0.3%牛血清白蛋白，3%胎牛血清，1 %青链霉素合剂的DMEM/F 12培养基重悬细胞，PI染色计数，调整细胞密度为5×105个/mL，转移到1.5 mL的离心管内，1 400 r/min 离心5 min后弃上清，立即将细胞投入液氮，后放入 -80 ℃ 冰箱保存，用于后续RNA提取。

1.3.2不同浓度FSH和抑制剂AT7867对GCs增殖影响

将分离纯化的绵羊颗粒细胞按相同浓度接种至96孔培养板中，每孔细胞进行随机分组进行后续试验。试验一将分组的每孔细胞分别添加0、5、10和20 ng/ mL FSH。培养24 h后，采用CCK-8法对不同时间检测细胞活性。观察FSH对绵羊卵巢GCs活性的影响。每组数据重复3 次以上。试验二将分组的每孔细胞分别添加0、5、10、20和40 μmol/L抑制剂AT7867，试验方法同试验一。观察抑制剂AT7867对卵巢GCs培养的影响。每组试验各重复3 次以上。

1.3.3GCs周期检测

培养24 h获得细胞，用不含EDTA的胰蛋白酶室温消化15～20 min，消化后经PBS清洗2～3次，1 400 r/min，离心5 min后，收集细胞沉淀后用70%预冷乙醇固定24 h左右。然后收集不同处理后固定的细胞样本，经PBS洗涤2～3次后，根据细胞周期试剂盒测定不同处理样本，每个样本添加100 μL Rnase酶吹打均匀后，37 ℃处理30 min，然后各孔添加400 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min，使用流式仪细胞检测细胞周期。

1.3.4GCs凋亡检测

将待检测细胞从培养箱取出，然后用预冷PBS清洗细胞2～3次；各孔加500 μL不含EDTA的胰蛋白酶，室温消化，待细胞完全脱落，用移液枪轻轻吹打使细胞分散；将所吸出EP管中培养液加到对应各孔细胞内，终止胰蛋白酶消化；然后将细胞悬液转入5 mL EP管内，1 400 r/min，离心5 min，弃上清，用1 mL PBS轻轻吹起沉淀细胞，洗涤2～3次，1 400 r/min，离心5 min后弃上清；按照细胞凋亡检测试剂盒说明书，每个样本加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，然后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，轻轻混匀，室温避光(锡箔纸)孵育10～30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.5qPCR检测GCs中基因表达

采用TRNzol法提取组织样品总RNA，使用NanoDropTMND-2000测定RNA浓度和纯度。要求A260/280介于1.8～2.1， 28S:18S)≥1.8∶1.0，浓度≥200 ng/uL。采用qRT-PCR技术定量分析PCNA、CCnd-2和Bcl-2基因在不同培养条件下获得颗粒细胞中的表达水平。采用Oligo 6.0软件设计qPCR并合成引物(表1)。分别采用Prime ScriptTMRT试剂盒和SYBY Premix ExTaqTM试剂盒(TaKaRa，日本)进行cDNA逆转录和qPCR反应，所有操作严格按照试剂盒说明书于IQ-5荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)上进行。qPCR反应体系为25 μL，包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq TM(2a)、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2.0 μL cDNA模板和8.5 μL ddH2O。反应程序：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 15 s，45个循环，延伸阶段收集荧光信号，70～95 ℃绘制溶解曲线。采用β-actin作为内参基因，每组数据重复3次以上。

表1 qPCR引物Table 1 Primers of qPCR

1.3.6Western blotting 法检测蛋白表达

准备进行SDS-PAGE的5%浓缩胶和12%分离胶。样品经缓冲液变性处理，上样，每孔20 μg。湿转膜法完成后经染色剂对膜进行染色并鉴定转膜效果。将转膜良好的膜完全浸没5%脱脂奶粉-TBST液中，室温轻摇封闭30 min，后用5%脱脂奶粉-TBST按1∶1 000稀释p-AKT和p-FOXO1抗体，室温震摇10 min，充分混匀抗体，置摇床震摇过夜。第2天使用TBST洗膜5次，每次5 min，用5%脱脂奶粉-TBST按1∶1 000 稀释二抗IgG，室温轻摇40 min，TBST洗膜6次，每次5 min，ECL孵育，最后化学发光成像仪成像。

1.3.7数据分析

采用2-ΔΔCT公式计算qRT-PCR结果，利用SPASS统计软件T-test进行差异显著性检验，数据以平均值±标准差(Mean±SEM)表示。每组试验数据重复至少3次。

2 结果与分析

2.1 FSH对GCs活性影响

在绵羊GCs培养基中添加浓度分别为0、5、10、20和40 ng/mL的FSH进行培养。每间隔1 d记录GCs增殖情况，接种当天记录0 d，及接种后1～6 d,结果见图1。10 ng/mL FSH培养GCs活性极显著高于其他处理组(P<0.01)。进一步证明FSH能显著提高GCs的增殖能力。

**表示差异极显著P<0.01。**indicates extremely significant difference (P<0.01).图1 不同浓度促卵泡素对体外颗粒细胞活性影响Fig.1 Effect of different concentrations of FSH on the GCs viability in vitro

2.2 FSH对GCs凋亡影响

将GCs接种6孔板培养24 h后，利用Annexin V-FITC/PI荧光染色。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果见图2：在10 ng/mL FSH培养下，GCs凋亡率极显著低于其他浓度FSH培养的GCs(P<0.01)。这一结果说明10 ng/mL FSH对绵羊GCs增殖有明显地促进作用，同时能显著抑制绵羊GCs凋亡。

*表示差异显著P<0.05；**表示差异极显著P<0.01。*indicates significant difference (P<0.05). **indicates extremely significant difference(P<0.01).图2 不同浓度促卵泡素对体外颗粒细胞凋亡影响Fig.2 Effect of different concentrations FSH on the apoptosis of the GCs in vitro

2.3 FSH对GCs周期的影响

分别将不同浓度FSH添加培养基中培养GCs 24 h后，使用PI染色检测细胞周期。由图3可见：添加10 ng/mL FSH后，细胞从 G1期到 S期过渡时期，细胞增殖数量出现显著提高(P<0.05)。由于GCs增殖速度和数量发生变化主要发生于细胞周期G1到S阶段过渡中。这一过程主要受卵巢内分泌因子与调节因子之间的相互作用，用以调节卵泡颗粒细胞增殖和分化。

不同字母表示差异显著P<0.05。Different letters indicate significant differences between groups (P<0.05).图3 不同浓度促卵泡素对体外绵羊颗粒细胞周期影响Fig.3 Effect of different concentrations FSH on the GCs cell cycle in vitro

2.4 抑制剂AT7867对GCs活性影响

使用AKT/FOXO1通路的抑制剂AT7867预处理GCs，根据抑制剂的不同浓度(0、 5、10、20和40 μmol/L)和不同时间(0、4、8、12、16、18、24、26 和28 h)测定GCs活性。结果表明10 μmol/L AT7867抑制剂孵育24 h，GCs活性极显著低于其他处理组(P<0.01)(图4)。抑制剂AT7867可阻断AKT发生磷酸化，进一步影响AKT信号通路下游靶基因FOXO1的转录水平，最终阻滞GCs增殖分化功能。

2.5 FSH通过AKT/FOXO1信号通路上调PCNA、Ccnd-2和Bcl-2

组1是GCs仅用培养基DMEM/F 12为对照组，组2为添加10 ng/mL FSH,组别3为添加10 μmol/L AT7867抑制剂，组别4是同时10 ng/mL FSH和10 μmol/L AT7867抑制剂，孵育24 h后,通过Wester-Blot检测，如图5(a)～(b)所示，与其他处理组相比，10 ng/mL FSH(4(a2))显著提高p-AKT(S473)蛋白的表达，降低p-FOXO1蛋白水平(4(b2))，同时上调绵羊GCs中PCNA、Ccnd-2和Bcl-2基因。如图5(c)～(e)。PCNA、Ccnd-2和Bcl-2是通过AKT/FOXO1信号通路参与细胞增殖，抑制细胞发生凋亡的生物学过程。

图4 不同浓度抑制剂AT7867对体外颗粒细胞活性影响Fig.4 Effect of different concentrations inhibitor AT7867 on the GCs viability in vitro

1：对照组；2：促卵泡素；3抑制剂AT7867；4：促卵泡素加抑制剂. **表示差异极显著P<0.01。1：Control； 2：FSH； 3：Inhibitor AT7867； 4：FSH+AT7867.**indicates extremely significant difference (P<0.01).图5 FSH通过AKT/FOXO1通路上调靶基因Fig.5 FSH up-regulate targeted genes by AKT/FOXO1 pathway

3 讨论与结论

哺乳动物卵巢卵泡的发育主要受垂体分泌的促性腺素调控。其中FSH是卵泡发育过程中形成优势卵泡的主导激素[16]。FSH通过靶器官细胞膜上的特异性受体FSHR介导，影响卵泡发育的成熟和卵泡数量。FSHR主要表达卵巢卵泡GCs，其表达水平与GCs存活、卵泡闭锁和卵母细胞成熟密切相关[17]。本试验通过添加不同浓度FSH对绵羊GCs进行24 h培养后，检测其细胞活性和凋亡，发现10 ng/mL FSH对绵羊GCs增殖有明显的促进作用，同时能显著减少绵羊GCs凋亡(图1和图2)。已有研究表明卵泡发育和闭锁调节是一个复杂的过程，涉及内分泌因子与卵巢调节因子之间的相互作用，从而控制卵泡细胞的命运(细胞增殖、分化和细胞程序性死亡)[18]。本试验中添加10 ng/mL FSH处理24 h后，检测到细胞从 G1期到 S期，发现细胞增殖数量出现显著提高。这与已有研究报道GCs增殖速度和数量发生变化主要发生于细胞周期G1到S阶段过渡中的结果一致[19-20]。

已有研究表明FSH下游的转录因子PCNA、Ccnd-2和BCl-2的特异性表达水平，主要受FOXO1调控[15-18]；而FOXO1主要受AKT磷酸化调控，由PI3K途径激活，调节细胞周期、代谢或存活[21-22]。其中：PCNA是真核细胞DNA合成时所必需的一种细胞核蛋白，在细胞核内合成，并储存核内。PCNA在细胞分裂期出现，其表达量的变化与DNA合成一致，与多种细胞周期调节因子和细胞增殖密切相关[16]。而Ccnd-2是参与调控细胞周期中G1期向S期过渡的重要蛋白[17]。Bcl-2作为G1/S期过渡阶段的重要的调控蛋白，一方面能够促进细胞增殖，抑制细胞发生凋亡；另一方面可以调节细胞氧化还原状态(非蛋白巯基、谷胱甘肽)，增强细胞抗氧化能力，减轻由氧化应激引起的细胞早期凋亡[23]。

在大鼠GCs的试验中证实，抑制FOXO1磷酸化水平，能增强细胞中PCNA和Ccnd-2基因的特异性表达水平，进而阻滞细胞发生凋亡[15]。进一步在大鼠肾小球系膜细胞的研究发现，FOXO1过表达会促使抗凋亡因子Bcl-2下调，导致细胞周期停滞，降低细胞增殖能力[24]。阻断AKT下游的FOXO1蛋白质的磷酸化水平，则导致下游靶基因的功能发生改变[25]

本研究结果表明： 10 ng/mLFSH处理能显著升高GCs中p-AKT蛋白水平和显著降低p-FOXO1的表达量，显著上调PCNA、CCnd-2和Bcl-2的转录水平；并能显著增强绵羊GCs活性和显著减少绵羊GCs凋亡。FSH通过AKT/FOXO1信号通路调控靶基因PCNA、CCnd-2和Bcl-2转录水平，本研究可为进一步探明绵羊GCs功能的分子机制研究奠定基础。