转录因子Nkx2.5、GATA4在先天性心脏病产前诊断中的研究

江敏　梁燕华　林丽虹

【摘要】 目的 研究转录因子Nkx2.5、GATA4在先天性心脏病（CHD）产前诊断中的临床价值。方法 50例超声心动图确诊胎儿为先天性心脏病的孕妇， 抽取孕妇羊水、脐血或引产胎儿脐血， 采用多重连接探针扩增技术（MLPA）检测， 分析其染色体核型、 MLPA检测结果。结果 50例先天性心脏病胎儿中6例染色体核型分析异常， 其中3例为21-三体综合征， 2例为18-部分三体综合征， 1例为46， XX，der（6） （q16q22）;剩余44例先天性心脏病胎儿染色体核型分析结果正常。50例先天性心脏病胎儿进行Nkx2.5、GATA4基因的突变筛查， 结果未发现任何突变。1例先天性心脏病患儿通过染色体微阵列分析（CMA）在染色体8p23.2位置检出一段约859 kb的拷贝数变异（CNV）， 涉及OMIM基因CSMD1等， 可能为多态改变。结论 先天性心脏病胎儿不存在Nkx2.5、GATA4基因异常， 这可能一方面是由于所选样本量过小， 有待于扩大样本量， 以便进行更广泛的筛查;另一方面也可能因为我国和国外的人种差异， 因此需进一步扩大先天性心脏病的样本数量进行更深入的研究， 以进一步揭示先天性心脏病的发病机制。

【关键词】 先天性心脏病;Nkx2.5;GATA4;产前诊断

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.04.091

先天性心脏病（congenital heart disease， CHD）近十年是我国出生缺陷的首位， 发病率在活产婴儿占8‰～12‰。我国每年大约10万～20万先天性心脏病新生儿出生， 广东省每年新增先天性心脏病新生儿至少7000例， 是我国城市0～5岁婴幼儿死亡的首要原因[1-3]。其遗传学病因有染色体病、单基因病、多基因病、线粒体病等。先天性心脏病的发病率占新生儿的0.4%～5.0%， 病因迄今仍不清楚。但研究认为， 先天性心脏病是由遗传因素和环境因素共同作用导致心脏血管发育异常所引起的， 遗传度为55%～65%， 并证实多种转录因子与心脏发育紧密相关， 包括GATA4、Nkx2.5、TBX5、AP2b等[4， 5]。本研究从分子水平观察了先天性心臟病患者的Nkx2.5、GATA4基因突变情况， 初步探讨两种转录因子与先天性心脏病发病的关系， 为先天性心脏病的产前诊断和基因治疗提供依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月～2017年12月本院超声心动图确诊胎儿为先天性心脏病的孕妇50例， 包括心脏扩大、室间隔缺损（VSD）、房间隔缺损（ASD）、单心房、法洛四联症（TOF）、心内膜垫缺损、右心室双出口、永存动脉干、大动脉转位、主动脉弓狭窄、肺动脉狭窄、主肺动脉窗等， 经过遗传咨询自愿行介入性产前诊断。孕妇年龄20～44岁， 平均年龄（26.5±2.8）岁;孕周20+4～33周， 平均孕周（26.5±2.2）周。所有孕妇均签署产前诊断知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本提取 经知情同意抽取孕妇的羊水或脐带血。妊娠18～24周孕妇：B超引导下经腹壁行羊膜穿刺抽取18～22 ml羊水， 使用2个无菌刻度离心管分装， 离心后弃上清， 每管留下约2 ml的细胞悬液， 加入培养基7 ml， 使用2个细胞培养瓶分别接种， 置恒温37℃， 5%CO2培养箱中， 培养9～10 d后换液， 细胞生长情况需要每天观察， 贴壁细胞生长旺盛时可作为收获节点， 出现较多透明圆形细胞时为明显标志， 常规制片、G显带。妊娠25～37周孕妇：B超引导下经腹壁行脐血细胞穿刺术， 循常规操作染色体制片， 在1640培养基中注入1 ml肝素钠抗凝的血标本以行淋巴细胞培养， 大约60～75 h后即可收获， 取常规G显带（400条带）制成所需染色体片。每例计数35个以上核型， 并对5～7个核型进行分析， 发现异常者可增加至17个核型分析。

1.2.2 DNA提取方法 ①羊水DNA提取：取5 ml羊水， 3000 r/min离心10 min， 弃上清， 用1 ml生理盐水漂洗2次， 12000 r/min离心5 min， 弃上清。根据基因组DNA提取试剂盒说明书抽提羊水基因组DNA， 并计算DNA的浓度。②脐带血DNA提取：取胎儿脐带血1～2 ml（EDTA抗凝）， 全基因组DNA可采用酚-氯仿法提取， DNA在260 nm和280 nm处的吸光值需用分光光度计法测定并提取， 从而得出浓度及纯度值， 并用TE溶液稀释终浓度至50 ng/?l。

1.2.3 MLPA检测方法 采用荷兰MRC-Holland公司生产的P311试剂盒， 包含了检测GATA4所有7个外显子及GATA4基因上下游序列、Nkx2.5基因所有2个外显子的探针。按MLPA试剂盒所提供的操作流程进行探针的杂交和扩增。检测扩增产物需在ABI3500遗传分析仪（Applied Biosystems）上进行， 并通过Genemapper3.7获取结果， 最后通过Coffalyser v9.4（MRC-Holland）进行分析得出基因相对拷贝数比值。

1.3 统计学方法 所得结果通过GenemarkerV 1.80 软件进行定量分析， 将获得的扩增产物峰的峰面积进行标准化， 并得到反映样本DNA片段扩增数目变化的比值， 以便于分析DNA片段变化的情况。

2 结果

2.1 染色体核型结果 50例先天性心脏病胎儿中6例染色体核型分析异常， 其中3例为21-三体综合征， 2例为18-部分三体综合征， 1例为46， XX， der（6） （q16q22）;剩余44例先天性心脏病胎儿染色体核型分析结果正常。

2.2 MLPA结果 50例先天性心脏病胎儿进行Nkx2.5、GATA4基因的突变筛查， 结果未发现任何突变。1例先天性心脏病患儿通过染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis， CMA）在染色体8p23.2位置检出一段约859 kb的拷贝数变异， 涉及OMIM基因CSMD1等， 可能为多态改变。

3 討论

先天性心脏病简称先心病， 是胎儿期心血管发育异常引起的血管畸形， 也是最为常见的血管畸形之一， 其发病率占出生活产婴儿的比例很高， 是新生儿致死致残的一个主要原因。先天性心脏病的发病机制复杂， 临床表现明显不同， 可能与遗传、宫内感染、大剂量放射性物质接触和药物等因素有关[6]。一些患儿症状明显， 一般在 0～15 岁的幼儿期即可发现;一些患儿可能无明显症状， 直至出现症状时才发现其患有先天性心脏病。根据先天性心脏病的严重程度， 外科修补或内科封堵手术都能有效的控制先天性心脏病。由于遗传基因突变导致的先天性心脏病， 即使做了心脏修补手术也可能出现一些其他的并发症， 如心律失常、心内膜炎和心力衰竭， 因此还需要注意观察， 有可能还需要额外的外科手术。值得一提的是， 先天性心脏病中的心脏传导系统异常是可以伴随患者终生的十分危险的致死病因， 且症状会随着年龄增加而呈现逐渐加重的趋势。因此， 对先天性心脏病患者进行遗传基因检测， 找出致病基因， 对患者术后的生活质量和生存率都至关重要。近期心脏发育中的一些转录调控回路的研究也发现心脏转录因子在先天性心脏病发生发展中也起着重要作用， 如转录因子 Nkx2.5、GATA4 和 TBX5 在心脏的早期发育中就都起着重要作用[7， 8]。因此， 本文旨在讨论心脏转录因子 Nkx2.5和GATA4在早期产前诊断中对心脏产生的重要作用及其突变导致的先天性心脏病表型， 并讨论其导致先天性心脏病的可能机制。

人类在胚胎期的心血管系统是在第3周开始发育的， 直到第8周结束。心脏发育起始于前面侧板中胚层内心脏祖细胞的分化。心脏的胚胎发育可分为分段发育、融合连接、扭曲旋转和顺序分隔4步。人类胚胎发育到第16～17天， 血管母细胞增殖形成鼓励的内皮细胞团;到第18～19天， 生心板形成;胚胎发育到第23天， 单个心管形成， 开始低效率的收缩;第26天， 单个心房心脏形成;第29天， 开始发育成两个心房;第30天血液循环系统开始运行， 第49天心脏四个腔室基本形成， 但要到出生才会发育为成熟的心脏。其中主要的发育包括心管的形成、心脏的扭转、心脏的环化、房室分隔、传导系统和血管的发育以及流出通道的形成。

研究表明[9]， Nkx2.5是心脏前体细胞分化的最早期标志之一， 参与心脏前体细胞分化、房室分隔、房室流出道的形成和传导系统的成熟;在发育成熟的心脏中， Nkx2.5表达局限在房室肌细胞中， 但对成熟心脏发挥正常功能却不可缺少。人类Nkx2.5基因定位于染色体5q34上， 有2个外显子， 编码324个氨基酸， 在进化上高度保守。其突变与多种先天性心脏病的形成有关， 如房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症和伴有传导系统病变的三尖瓣下移畸形。有研究表明[10]， 几乎所有类型的先天性心脏病都存在Nkx2.5基因的突变， 国外已经发现41种突变报道， 其中33种单核苷酸置换， 6种核苷酸缺失， 2种核苷酸插入。McElhinney等[11] 报道NK2.5基因外显子1的突变存在于各种先天性心脏病中， 但国内却少有发现报道。2005年， 石琳等[12]对包括室间隔缺损、法乐四联症、房间隔缺损、完全性肺静脉畸形引流、完全性大动脉转位在内的110例中国先天性心脏病患儿及110例正常对照者的NK2.5基因外显子1及其侧翼进行突变检测， 结果任何突变位点都未被发现， 但是发现了1个新的SNP位点63A>G（rs2277923）。对其基因型和等位基因频率变化的分析发现， 对照组和病例组都显示G基因型高于基因库中所标示的基因型A， 对照组中G基因型达到了62%， 而病例组中的室间隔缺损和法乐四联症组中G基因型则均达到了87%， 该SNP在两组病例与对照组之间明显存在着显著的相关性。韩增强等[13]对81例单纯性先天性心脏病患者的研究发现， Nkx2.5基因突变与我国单纯性先天性心脏病之间无明显相关。国内简永远等[14]对30名广西壮族ASD患者及30例广西壮族对照病例进行Nkx2.5基因的突变筛查中， 结果并未发现任何突变。关于散发先天性心脏病人群的突变研究， 张为民等[15]筛查了120例维吾尔族ASD患者， 也并未检测出任何Nkx2.5基因突变。

GATA4基因定位于8p23.1-p22， 是心脏发生调节网络中重要的蛋白， 是在心脏早期发育中起关键作用的转录因子之一， 并且相互作用于其他转录调节因子， 是心脏细胞胚胎发育过程中的早期标志， 并调控心肌细胞的分化增生及心脏的形态发生过程[16-18]。首先在心前期中胚层表达， 随后在心内膜与心肌中表达， 并参与调节表达心脏结构基因， 主要包括心脏肌球蛋A重链-α（α-Myhc）、心肌钙蛋白C、心房利钠肽因子（ANF）等， 也通过其锌指结构与其他心脏特异性的转录因子（如Nkx2.5、TBX5等）相互作用共同发挥转录调控作用[19-21]。该基因单个或多个突变及异常表达均会导致心脏结构畸形， 如室间隔缺损、房间隔缺损、房室间隔缺损、心内膜垫缺失、右心室双流出道、左心发育不全综合征、肺动脉缩窄、动脉导管未闭等。自2003年Garg等首次证实转录因子GATA4突变是导致人类先天性心脏病的致病原因之一。随后有多个研究报道GATA4突变与人类先天性心脏病相关[17， 18， 20]。汪希珂等[16]对198例先天性心脏病患者研究发现2例GATA4位点杂合突变。

本研究未发现先天性心脏病胎儿存在Nkx2.5、GATA4基因异常， 这可能一方面是由于所选样本量过小， 因此有待于扩大样本量， 以便进行更广泛的筛查;另一方面也可能因为我国和国外的人种差异。同种疾病可能有不同类型的基因突变， 即由遗传的异质性决定， 可能Nkx2.5、GATA4基因并非是我国先天性心脏病的主效基因。同时进一步提示先天性心脏病有着复杂的发病机制， 并提示可能的多基因相互作用、可能的环境一遗传因素的相互作用， 需进一步扩大先天性心脏病的样本数量进行更深入的研究， 以进一步揭示先天性心脏病的发病机制。

参考文献

[1] 贾安琪， 邱海燕， 吴军华， 等. 新生儿危重先天性心脏病筛查研究进展. 临床荟萃， 2017， 32（1）：89-92.

[2] 黄国英. 我国开展新生儿先天性心脏病筛查的重要性. 中华儿科杂志， 2017， 55（4）：241-243.

[3] 徐金玉. 先天性心脏病发病机制中遗传因素的研究进展. 中华妇幼临床医学杂志（电子版）， 2017， 13（5）：611-615.

[4] 孙慧超， 田杰. 先天性心脏病遗传机制研究进展. 中华实用儿科临床杂志， 2019， 34（13）：970-975.

[5] 朱耀斌， 李志強， 丁楠， 等. 先天性心脏病患儿术后心脏康复研究进展. 中华实用诊断与治疗杂志， 2019（4）：410-413.

[6] 苏晗， 朱华， 朱华， 等. GATA家族基因突变与先天性心脏病的研究进展. 国际儿科学杂志， 2019， 46（3）：194.

[7] 许展毓， 冯旭， 郑宝石， 等. 先天性心脏病与同源蛋白NKX2.5基因突变的关系. 中华实验外科杂志， 2018， 35（1）：149-151.

[8] 陈乐陶， 杨土保， 王婷婷， 等. 中国人群心脏转录因子的单核苷酸多态性与先天性心脏病关系的Meta分析. 中国当代儿科杂志， 2018， 20（6）：63-69.

[9] 王佼， 朱善良， 杨世伟， 等. NKX2.5、GATA4、TBX5基因突变与散发性先天性心脏病的相关性研究. 中国循环杂志， 2014（z1）：33-34.

[10] 黄雄， 仇小强， 曾小云， 等. Nkx2.5、GATA4和TBX5基因多态性与广西壮族、汉族儿童室间隔缺损的关系研究. 中国妇幼保健， 2016（31）：2513.

[11] McElhinney DB， Geigere， E， Blingder J， et al. Nkx2.5 mutations in patients with congenital heart disease. J Am Coll cardiol， 2003（42）：1650-1655.

[12] 石琳， 申阿东， 李晓峰， 等. 中国先天性心脏病NK2. 5基因突变筛查及关联研究. 首都医科大学学报， 2005， 26（5）：525-528.

[13] 韩增强， 唐胤， 陈彧， 等. 81例单纯性先天性心脏病患者Nkx2.5基因突变筛查及关联研究. 中国循环杂志， 2011， 26（6）：461-464.

[14] 简永远， 许展毓， 冯旭， 等. Nkx2.5基因突变与广西壮族人群先天性房间隔缺损的关系研究. 微创医学， 2018， 13（4）;417-419.

[15] 张为民， 拜合提亚尔·克然木， 阿不都沙拉木·吐尔逊， 等. 新疆维吾尔族房间隔缺损患者Nkx2.5基因突变研究. 中国优生与遗传杂志， 2016（12）：13-16.

[16] 汪希珂， 王予川， 吴悦， 等. 转录因子GATA-4， -5， -6在中国人群先天性心脏病患儿中的突变筛查. 中华实用儿科临床杂志， 2016， 31（1）：55-58.

[17] 刘汉婕， 李霞， 梁亚男， 等. 心脏发育中重要转录因子Nkx2.5、GATA-4和Tbx5与先天性心脏病的致病性. 国际遗传学杂志， 2018， 41（5）：403-413.

[18] 李开如. 先天性心脏病相关转录因子Nkx2.5、GATA4的初步研究. 东南大学， 2009.

[19] 许耘红， 何穗镕， 李丽青. 心肌转录因子和锌指转录因子在先天性心脏病中的相互作用. 中国临床药理学杂志， 2017（18）：1773-1775.

[20] 孙颖. 心脏发育相关基因Nkx2.5和GATA4突变与先天性心脏病的研究. 苏州大学， 2010.

[21] 方翔， 丁建东. 转录因子Nkx2.5和GATA-4在心脏发育中的作用. 医学综述， 2009， 15（22）：3366-3369.

[收稿日期：2019-12-10]