小鹅瘟诊断技术研究进展

张淑莹，阮洪玲，文双云，卢松岩

1.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062；2.长春市双阳区畜牧总站，吉林长春 130600；3.吉林市船营区畜牧兽医科学研究会，吉林吉林市 132012

小鹅瘟又称鹅细小病毒感染，也称德兹西式病。感染的主要对象是雏鹅和雏番鸭，以3～20日龄最易感染，传播速度快，且以大面积爆发的流行趋势出现。感染后临床症状表现为精神萎靡，食欲不振，昏睡，严重腹泻，病鹅出现稀粪，濒死前有明显神经症状出现，颈部发生较大程度扭转，解剖后可见肝脏发生明显肿大，质地脆化，颜色呈古铜色，胆囊、肾脏肿胀，输尿管可见尿酸盐沉积。典型病例解剖病变样本可见小肠黏膜有大片坏死脱落和凝固，形成灰色或淡黄色的栓塞物，形如腊肠状，将肠管全部堵塞。

1956 年，方定一等人发现此病，并于1961年成功从病死雏鹅体中分离到病毒毒株，同时证明是一种新的病毒，将其暂定名为“小鹅瘟”。1966年，匈牙利科学家德兹西在鹅胚中分离到小鹅温病毒毒株。1974年，世界家禽协会将该病命名为德兹西式病。时至今日，我国小鹅瘟的首次研究内容被国际禽类巨作《禽病学》引用。近年来，对小鹅瘟诊断技术的研究不断创新，在特异性更强的免疫学和分子生物学方面不断取得技术突破。本文就小鹅瘟诊断技术研究成果进行综述，为后续研究提供参考。

对于小鹅瘟的诊断，常见的方法可归纳为病毒的分离、检测和鉴定与血清特异性抗体的检测两类。最早建立的检测方法是琼脂扩散试验，随着免疫学与分子生物学技术的迅猛发展，农业农村部于2018年5月7日发布了新修订的农业行业标准NY/T 560-2018《小鹅瘟诊断技术》，适用于小鹅瘟病毒分离、病毒分离株的鉴定、鹅群小鹅瘟检疫、流行病学调查和免疫鹅群抗体水平的检测，对小鹅瘟诊断的科学、准确、规范起到了积极地促进作用。

1 病毒的分离、检测和鉴定

1.1 病毒的分离

无菌环境下取病死雏鹅的肝、脾、肠等内脏器官剪碎磨细，用灭菌生理盐水或PBS 制成乳剂，接种在鹅胚或番鸭胚尿囊腔内。翌日无菌收集尿囊液，盲传一代。随着病毒细胞传代数量增加，培养3～5d 后，肉眼观察可见胚体病变越来越明显，规律性越来越强，绒尿膜增厚，翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙均有严重出血点，头部皮下水肿。胡桂学等人[1]根据病毒粒径和外部形态特征，在电子显微镜下进行磷钨酸负染观察，可见聚集状态的病毒粒子，这是因为在发病初期小肠带有一定数量的病毒粒子，到发病后期，机体产生了抗体，而病毒粒子与抗体发生特异性结合形成免疫复合物，使病毒粒子发生聚集，从而有利于对分离到的小鹅瘟病毒粒子进行电镜观察，该方法检测准确、快速，但是操作具有一定难度且成本较高，不适合在基层应用。

1.2 琼脂扩散试验

琼脂扩散试验是检测小鹅瘟病毒最经典的方法之一。 其原理是将琼脂凝胶作为抗原扩散，与阳性血清发生反应的载体，当待检抗原孔与阳性血清孔之间出现沉淀线，且与标准抗原沉淀线末端相吻合，判为阳性；无沉淀线出现，判为阴性。同样的试验原理，使用标准琼扩抗原，可以检测血清特异性抗体。秦爱建等人[2]成功建立免疫酶琼脂扩散试验方法，用于检测鹅胚尿囊液中的小鹅瘟病毒抗原，以及经过免疫的鹅的抗体水平，其灵敏度是普通琼脂扩散试验的236 倍。2004年11月17日，国家质量监督检验检疫总局发布出入境检验检疫行业标准SN/T 1467-2004《小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散试验方法》。该方法准确率高、操作简捷、成本低廉，适合在基层应用。

1.3 酶联免疫吸附试验

1966 年，酶联免疫吸附试验首次用于液体样品中微量物质的测定，酶的催化频率很高，放大反应效果，因此具有很高的敏感度。近年来，先后建立了斑点酶联免疫吸附试验、亲和素-生物素-酶复合物酶联免疫吸附试验、间接酶联免疫吸附试验、夹心酶联免疫吸附试验等方法检测小鹅瘟病毒，具有敏感、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，是重要的诊断方法之一。

1.4 冰冻切片免疫荧光方法

采集病死鹅肝脏、肠管、脾脏等割成小块，包埋剂覆盖，速冻后进行切片，用丙酮乙醇溶液固定。将冰冻切片置于含有小鹅瘟单克隆抗体的PBS 中水浴，洗涤后置于FITC标记的羊抗鼠IgG中水浴孵育，洗涤后加入50%甘油PB 封片。荧光显微镜下观察，见亮绿色荧光即为阳性，未见荧光即为阴性。该方法在检测过程中，应与已知阳性和阴性冰冻切片共同操作，建立标阴标阳，对检测过程进行质量控制。

1.5 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应简称PCR。采集病死鹅肝脏、肠管、脾脏等研磨，提取DNA，通过PCR 仪扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，最后由紫外凝胶成像系统观察结果[3]。样品扩增产物电泳出现776 bp 目标条带即为阳性，无扩增条带为阴性。赵妍等人[4]成功建立双重PCR 方法检测小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒，提高了检测效率，为多病种同步鉴别诊断提供了思路。

2 血清特异性抗体的检测

2.1 中和试验

抗体与病毒特异性结合，抑制其对敏感细胞的吸附、穿入和脱壳，从而抑制增殖，失去感染性和致病力。鹅胚接种样品和不同浓度的小鹅瘟病毒，观察生长发育情况，计算半数鹅胚致死量和中和指数进行结果判定。同样的试验原理，使用抗小鹅瘟高免血清，可以鉴定是否为小鹅瘟病毒感染。该方法不但可以定性，还可以定量，特异性强，稳定性好，但是检测周期长，在临床应用上，不适合批量检测。

2.2 免疫荧光试验

制备小鹅瘟病毒抗体检测板，加入稀释的样品和标阴标阳血清，水浴并洗涤，加入抗鹅IgG 单克隆抗体，水浴并洗涤，加入FITC 标记的羊抗鼠IgG，水浴并洗涤，加入50%甘油PB 覆盖。荧光显微镜下观察，见亮绿色荧光即为阳性，未见荧光即为阴性。郭卉等人[5]成功建立间接免疫荧光法检测小鹅瘟病毒，由于二抗的信号放大效应，相较直接免疫荧光法而言就有更高的敏感性。

3 展望

从小鹅瘟的传播途径和主要侵害对象来看，净化尤其是种源环节净化是最佳防控手段。疫病的净化是通过监测来实现的，监测对诊断技术的要求就是：采样方便、检测快捷、结果准确、成本低廉。面对小鹅瘟净化过程中，高频率、多批次、大通量的检测任务，现有的检测方法稍显不足。未来将进一步推动相应探索，随着对小鹅瘟研究的不断深入，生物工程学的不停发展，检测方法的持续进步，相信小鹅瘟诊断技术将会取得突破性进展，服务于生产实际，促进养鹅业持续健康发展。