嗜热链球菌等六种微生物对AFB1 降解能力的研究

■赵雪芹 朱风华 陈 甫 边学伟 朱连勤*

(1.青岛农业大学动物医学院，山东青岛266109；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109)

霉菌毒素是霉菌产生的有毒的次级代谢产物，据报道目前已知的霉菌毒素有300多种，这些毒素对人和动物都具有潜在的毒性[1]，不仅严重影响畜禽生产性能，还可残留在畜禽体内各组织器官，从而影响动物源性食品的安全。黄曲霉毒素B1（AFB1）是饲料中最常见的霉菌毒素之一。2019年，朱风华等采集山东省各地饲料原料2 237份及配合饲料1 432份进行霉菌毒素检测，结果显示，饲料原料中AFB1污染率为39.20%，超标率为7.18%；配合饲料中AFB1污染率为45.88%，超标率为2.74%[2]。黄俊恒等对全国19省市饲料及饲料原料的检测结果显示，饼粕类样品受AFB1污染最为严重，超标率为13.2%，超标样品AFB1 含量的均值为49.5 μg/kg[3]。动物采食了含有AFB1的饲料后通常出现生长缓慢、饲料利用率降低、产蛋量和产奶量下降、繁殖率降低的现象。AFB1具有肝脏毒性，靶器官为肝脏[4]，还可引起动物免疫抑制[5]。常用的霉菌毒素脱毒方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法由于本身的实施过程或者所用试剂存在诸多缺点，而且不能彻底去除霉菌毒素，不能在实际生产中广泛应用。微生物降解法是近几年来研究的热点，相比物理法和化学法微生物降解具有效率高、特异性好、不影响饲料营养价值等优点。

本研究为了探索益生菌作为生物脱毒方法对饲料中AFB1的降解效果，选择了迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、嗜热链球菌、米曲霉6 种饲料中允许添加的微生物分别检测其对AFB1 的降解效果和降解产物，并研究了高效降解菌株在实际应用中对霉变饲料的最佳发酵条件。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

10365 迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、22096 短小芽 孢 杆 菌(Bacillus pumiluss)、2013 米 曲 霉(Aspergil⁃lus oryzae)、10344 乳酸片球菌(Pediococcus acidilacti⁃ci)、6063嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、6226罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 主要试剂

黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素M1（AFM1）、黄曲霉毒醇标准品购于美国Sigma 公司；乙腈（色谱纯）。LB培养基、MRS培养基、PDB 培养基、TPY 培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 试验菌株准备

在无菌操作台中，将所需的菌株分别接种到相应的液体培养基中，迟缓芽孢杆菌及短小芽孢杆菌接种于LB培养基，米曲霉接种于PDB培养基，乳酸片球菌接种于MRS 培养基，嗜热链球菌及罗伊氏乳杆菌接种于TPY 培养基。相应温度下120 r/min 培养24 h，按4%的接种量分别接种到装有5 ml相应液体培养基的试管中，120 r/min相应温度下继续培养24 h，重复以上操作直至菌体活力充分恢复。利用分光光度计和平板计数相结合的方法进行活菌检测，绘制生长曲线。将活化后的所试菌株，按4%的接种量接种到5 ml相应液体培养基中，37 ℃摇床培养18～20 h；并按照菌体生长曲线调整到供试菌悬液的浓度108CFU/ml。

1.4 高效降解AFB1菌株筛选

AFB1 纯品溶解于乙腈溶液，制成100 μg/ml 母液，分别配置0、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1 μg/ml AFB1溶液，制定AFB1标准曲线。

取1%的菌液的混悬液添加到含有AFB1 的4 ml培养基中，终浓度为0.5 μg/ml，在恒温震荡培养箱中适宜温度下震荡培养24 h。对照组只含有毒素，每种菌设4个重复。前处理：取样品1 ml菌液，-80 ℃冰箱冷冻4 h，冷冻干燥24 h，用84%的乙腈水1 ml 复溶。之后将溶液通过0.22 μm 的有机相膜转入空的液相瓶中，采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法进行样品分析。降解率(%)=[（对照组毒素含量-处理组毒素含量）÷对照组毒素含量]×100。

1.5 嗜热链球菌降解AFB1的产物分析

将筛选所得的高效降解菌株与AFB1 共培养，方法同1.4 节。AFM1、黄曲霉毒醇纯品溶解于乙腈溶液，制成100 μg/ml母液，冰箱4 ℃保存备用。分别配置0、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1 μg/ml AFB1溶液，制定毒素标准曲线。参照1.4 节进行样品前处理，采用HPLC-MS方法进行降解产物分析。

1.6 筛选嗜热链球菌降解霉变饲料中AFB1 的最佳发酵条件

采用二次回归正交旋转组合试验设计法，设定4个试验因素：发酵时间（X1）、水分含量（X2）、发酵温度（X3）、接种菌量（X4），设计4因素5水平的二次回归正交试验。通过进行单因素试验确定AFB1发酵因素设定范围为发酵时间72～120 h、含水量55%～65%、接种量6～10×108CFU/g、发酵温度43～44 ℃。AFB1因子水平编码如表1。采用SAS统计软件中rsreg多项式的回归模型和反应面分析程序，建立4因素5水平的回归方程，选取54个方案因变量最大预测值为最佳方案。

1.7 发酵条件验证

配制20 kg玉米-饼粕混合饲料（60%玉米、20%豆粕、10%花生粕、5%棉籽粕、5%DDGS），加一定量的水混匀，放置于生化培养箱中28 ℃培养28 d。取霉变饲料，60 ℃烘干恒重。磨碎，过40目筛，称取5 g，加入50 ml锥形瓶中，再向锥形瓶中加20 ml 84%乙腈水，加塞，放置摇床里37 ℃、120 r/min、2 h。过滤到离心管中。根据预测值的发酵条件进行验证试验，设3次重复，采用HPLC-MS方法检测发酵后霉变饲料中AFB1含量。

表1 AFB1发酵霉变饲料因子水平编码

1.8 质量控制

精密度试验：取浓度为1 μg/ml的AFB1标准品溶液，连续进样6 次，记录AFB1 的峰面积，计算相对标准偏差为1.35%。

回收率试验：在空白培养基样中分别添加0.25、0.5、1 μg/ml不同浓度的标准溶液，按照上述处理方法进行样品处理之后上机检测，每个样品平行测定6次。回收率分别为95.5%、98.1%、96.8%，相对标准偏差分别为2.29%、1.97%、2.76%。

1.9 数据处理

数据采用EXCEL进行初步处理，采用SAS 9.3统计软件中Anova模块进行方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 高效降解AFB1菌株筛选

表2 微生物对AFB1的降解率

如表2 所示，6 种微生物与AFB1 共同培养24 h后，除短小芽孢杆菌试验组外，其他试验组中AFB1浓度均显著低于空白对照组(P＜0.05)。嗜热链球菌对AFB1的降解率显著高于其它几种菌(P＜0.05)。乳酸片球菌对AFB1的降解率显著高于短小芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、米曲霉菌、罗伊氏乳杆菌(P＜0.05)。罗伊氏乳杆菌对AFB1的降解率显著高于迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和米曲霉菌（P＜0.05）。米曲霉菌对AFB1的降解显著高于短小芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌（P＜0.05）。迟缓芽孢杆菌降解率显著高于短小芽孢杆菌(P＜0.05)。

2.2 嗜热链球菌降解AFB1的产物分析

HPLC-MS检测结果显示，嗜热链球菌降解AFB1的降解产中含有AFM1，含量为0.011 8 μg/ml，转化率为2.36%。样品中未发现黄曲霉毒醇。

2.3 嗜热链球菌降解霉变饲料中AFB1 的最佳发酵条件

根据正交旋转组合编码表，按照相应条件进行试验，得出试验结果如表3。

2.3.1 方差分析

对表3 试验数据进行分析，缺失拟合＞0.05，说明拟合平方和技术上是由试验误差等偶然原因造成的；总模型＜0.01，说明回归方程具有很好的预测性能。

2.3.2 T检验

模型回归系数的T 检验结果表明，X1、X3、X1X1、X2X1、X3X3、X4X2、X4X4，对试验结果有显著影响(P＜0.05)。X3、X1X1、X3X3、X4X4对试验结果有极显著影响(P＜0.01)。为了保证方程的预测更加准确，保留全部回归系数在方程中。

2.3.3 两因素交互效应分析

交互作用的X2X3分析：将因素X1、X4固定在0 水平上，得到交互效应方程，用SAS 9.3 rsreg软件，做交互效应X2、X3的三维曲面图和等高线图，通过图形分析，可了解交互作用X2、X3对嗜热链球菌对AFB1的降解效果的影响。当发酵时间（X1）和接种量（X4）控制在0 水平时，水分含量（X2）在（-2、-1、0、1、2）任意水平时，降解率随温度的升高而升高，当降解率达到最大值后随温度的升高而下降。发酵温度（X3）在（-2、-1、0、1、2）任意水平，降解率随水分含量的升高而升高，达到最大值后随水分含量的升高出现下降。水分和温度对降解率的影响较大，水分取中间值水平，温度取中间值时降解率较大。

表3 正交旋转组合及试验结果

交互作用的X1X4分析：同理，当水分含量（X2）和温度（X3）固定在0 水平时，发酵时间（X1）取（-2、-1、0、1、2）任意水平时，降解率随接种量的增加而增大，达到最高值后随接种量的增大逐渐减小。将接种量（X4）取（-2、-1、0、1、2）任意一水平时，降解率随发酵时间的增加而增加，到达最高值后随时间的增加而下降。当水分含量和温度固定时，接种量取中间值，发酵时间取中间值，降解效果较好。

2.3.4 模型的建立与检验

利用SAS软件从嗜热链球菌降解霉变饲料AFB1的降解试验的54个组中选取降解最佳的5%的组，即降解率高于40.637%的31个方案。通过95%的置信区间预测值和自变量频率，可以确定嗜热链球菌降解AFB1的最佳发酵条件范围：发酵时间72.86～120 h，水分含量60.06%～65.96%，发酵温度43.75～44 ℃，接种量6.072～10.0×108CFU/g，最佳发酵条件为：发酵时间120 h，发酵水分65%，发酵温度44 ℃，接种量7×108CFU/g。

2.4 最佳发酵条件验证

对最佳发酵条件的预测值进行验证，即发酵时间120 h、发酵水分65%、发酵温度44 ℃、接种量7×108CFU/g，结果如表4。按照预测值进行试验，发现3次重复试验降解率均值为41.71%，略高于预测值，基本符合预测值。

表4 验证试验

3 讨论与结语

近几年的相关调查报告显示[6-7]，AFB1 广泛存在于各种饲料及饲料原料中[8]，存在范围广，污染程度高，对动物健康危害风险高[9-10]。随着相关生物技术的应用，越来越多具有降解能力的菌株被发现[11-14]。本试验发现嗜热链球菌对AFB1的降解能力优于其他试验菌株。Shahin[15]从酸奶中分离得一株嗜热链球菌，发现其对AFB1的降解率达96%，本试验中嗜热链球菌对AFB1 的降解率为80.0%，低于Shahin 的研究结果，可能与菌株或试验条件有关。

本试验利用高效液相色谱-质谱联用（HPLCMS）对AFB1降解产物黄曲霉毒醇和AFM1进行检测，发现降解产物中含有微量黄曲霉毒素M1，其毒性较小。没有发现黄曲霉毒醇。嗜热链球菌在培养过程中会产生β-半乳糖苷酶和胞外酶[16-17]，这两种酶能与AFB1发生酶解反应，使AFB1降解为黄曲霉毒素M1。嗜热链球菌还会产生乳酸和叶酸，能抑制AFB1 产生。相关研究[18-22]表明嗜热链球菌主要是菌体的吸附作用来达到除去AFB1的目的。但这种吸附作用是可逆的，络合物的稳定性与处理条件和环境条件有关，高热和强酸会引起结合可逆性的发生，但嗜热链球菌的热稳定性较好。

本试验发现嗜热链球菌降解AFB1的最佳发酵条件为：发酵时间120 h、发酵水分65%、发酵温度44 ℃、接种量7×108CFU/g。朱新贵等[22]报道了时间和温度对乳酸菌和枯草芽孢杆菌降解AFB1 的影响，他发现在培养36 h时乳酸菌和枯草芽孢杆菌对AFB1的降解率分别为36%、38%，在60 h 时降解率达88%和89%，在66 h时降解率仍为88%和89%，说明在其他条件一定情况下适当延长培养时间能提高降解率；他还发现枯草芽孢杆菌在25 ℃时降解率为74%，30 ℃时AFB1的降解率为82%，40 ℃时降解率为78%，由此可见，在一定条件下温度过高或过低会影响降解率，而且还会影响微生物酶的活性。很多研究都证明了这一点[23-24]。接种菌量对降解率也有重要影响，Nezami等[25]对其研究发现的几种能降解AFB1的菌的接种量做出说明，他发现培养液中的活菌数达到2×109CFU/ml时，降解效果最好。按照最佳发酵条件对自然霉变的饲料进行验证，嗜热链球菌对AFB1 的降解率均值为41.71%，低于我们在筛选高效降解菌株时嗜热链球菌对培养基质中AFB1的降解率，这可能与饲料粒度、饲料成分复杂多变有关。也可能与饲料发酵过程中影响到嗜热链球菌的活力有关，需要进一步研究证明。综上所述，嗜热链球菌可降解饲料中AFB1，可降低AFB1对动物健康危害的风险。