橘红颗粒特征图谱研究

彭善贵 王良 文永盛

[摘要]目的 研究橘紅颗粒的特征图谱，为科学评价和有效控制质量提供可靠方法。方法 采用高效液相色谱法（紫外检测）对橘红颗粒成分进行测定，以Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，流动相为乙腈-水，进行梯度洗脱，体积流量为0.5 ml/min，柱温30℃，检测波长为283 nm。供试品溶液制备采用甲醇直接超声处理进样。对橘红颗粒处方中7味药材的主要成分进行检测，建立橘红颗粒特征图谱。结果 橘红颗粒特征图谱有11个共有峰，分别归属了处方中的化橘红、陈皮、甘草、桔梗、地黄、瓜蒌皮和款冬花7味药材，并且确认了特征峰5为甘草苷，峰7（S）为参照物柚皮苷，峰9为橙皮苷。精密度、重复性、稳定性试验结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD均<1.0%，其相对峰面积的RSD均<4.0%。结论 建立的橘红颗粒特征图谱分析方法简单、准确，可用于橘红颗粒的质量控制和评价。

[关键词]橘红颗粒;高效液相色谱法;特征图谱;质量和控制评价

[中图分类号] R917          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）3（a）-0009-06

Study on characteristic chromatogram of Juhong Granules

PENG Shan-gui   WANG Liang   WEN Yong-sheng▲

Chengdu Institute of Food and Drug Inspection， Sichuan Province， Chengdu   610045， China

[Abstract] Objective To study the characteristic chromatogram of Juhong Granuls and provide a reliable method for scientific evaluation and effective control of quality. Methods High performance liquid chromatography （ultraviolet detection） was used to determine the components of Juhong Granuls， Sunfire C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） was used as the chromatographic column. The mobile phase consisted of acetonitrile-water， with gradient elution at the flow rate of 0.5 ml/min， column temperature was 30℃. Detection wavelength was 283 nm. The sample solution was prepared by direct ultrasonic treatment with methanol. The main components of seven herbs in the prescription of tangerine granules were detected and the characteristic spectrum of tangerine granules was established. Results There were 11 common characteristic peaks of Juhong Granuls， and the characteristic chromatographic peaks were classified into seven medicinal herbs in the prescription， namely， Citrigrandis Exocarpium， Citripericarpium Reticulatae， Glycyrrhizae Radixet Rhizome， Plycyrrhizae Radix， Rehmanniae Radix， Trichosanthis Pericarpium Farfarae Flos， and the characteristic peak 5 was glycyrrhizin， peak 7（S） was the reference naringin and peak 9 was hesperidin. The precision， repeatability and stability test results showed， the RSD of the relative retention time of each common peak was less than 1.0%， and the RSD of the relative peak area was less than 4.0%. Conclusion The etablished characteristic chromatogram method of Juhong Granuls is simple， accurate， and can be used for the quality control and evaluation of Juhong Granuls.

[Key words] Juhong Granuls; High performance liquid chromatography; Characteristic chromatogram; Quality and control evaluation

橘红颗粒具有清肺、化痰、止咳的作用，用于痰热咳嗽、痰多、色黄黏稠、胸闷口干。橘红颗粒标准收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部[1]（以下简称《中国药典》）。橘红颗粒处方由化橘红、陈皮、法半夏和浙贝母等15味药物组成，制法上采用全部药材水煎煮。标准中仅用薄层色谱法鉴别了陈皮和浙贝母药材，用高效液相色谱法测定了化橘红的主要成分柚皮苷的含量[1]。另外现有的资料和文献都是单味药材含量测定或薄层鉴别，基本没有反映复方制剂橘红颗粒较为全面的质量评价方法[2-9]。中药特征图谱是一种多指标的质量控制模式，它可以比较全面的反映所含化学成分的种类和数量，从而能够全面、综合地反映和控制中药的质量[10-13]。本研究为专项抽验评价研究，为了真实地反映橘红颗粒内在成分的整体特性，科学评价其质量的均一性和稳定性，采用自制橘红颗粒与专项抽验的198批次橘红颗粒制剂进行了特征图谱考察研究。根据实际情况，采用高效液相色谱法建立橘红颗粒的特征图谱，现报道如下。

1仪器、试药与试剂

1.1仪器

Anilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦公司），Anilent 1260 DAD检测器，LC open LAB自动进样色谱工作站，AE-240电子天平（德国赛多利斯公司），SK250H超声仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2试药与试剂

对照品：柚皮苷对照品（批号：110722-201613，纯度：94.3%），橙皮苷对照品（批号：110721-201611，纯度：96.1%），甘草苷对照品（批号：111610-201607，纯度：93.1%），均由中国食品药品检定研究院提供。

橘红颗粒样品：198批为2018年四川省评价性抽验样品，均符合规定（四川省食品藥品监督管理局组织的2018年评价性抽验专项工作，抽样地域覆盖了全省21个地、市、州。涉及批准文号13个，占全部批文的48.2%。生产企业13家，占全部生产厂家的50.0%）。化橘红（Citrusgrandis Exocarpium）、陈皮（Citripericarpium Reticulatae）、法半夏（Pinelliaerhizome Praeparatum）和浙贝母（Fritillariaethunbergii Bulbus）等15味中药材均为广州白云山中一药业有限公司提供的生产橘红颗粒所用的处方投料药材。经本院中药室主任中药师周世玉鉴定均符合《中国药典》[1]要求。课题组按《中国药典》[1]“橘红颗粒”质量标准收载的处方与制法自制橘红颗粒样品1批。

流动相中的甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂试药均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相A：乙腈、流动相B：水溶液，按流动相梯度表（表1）进行梯度洗脱;流速为0.5 ml/min;柱温30℃;检测波长为283 nm。

2.2溶液的制备

2.2.1参照物溶液的制备  取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升约含0.1 mg的溶液。

2.2.2供试品溶液的制备  分别取橘红颗粒样品（广州白云山中一药业有限公司，批号W00003M）和自制橘红颗粒样品，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，橘红颗粒供试品溶液和自制橘红颗粒供试品溶液。

2.2.3阴性溶液的制备  取不加化橘红、陈皮、法半夏和浙贝母等15味药物的空白样品，按“2.2.2”项下的橘红颗粒供试品溶液制备方法，制成溶液，即得。

2.4专属性试验

取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”项下溶液，按“2.1”试验条件，分别进样测定，并对色谱图中出峰时间5 min后的峰，进行了积分处理。图1～4分别为柚皮苷对照品溶液、橘红颗粒供试品溶液、自制橘红颗粒供试品溶液及橘红颗粒阴性溶液的高效液相色谱图。结果显示，橘红颗粒样品（广州白云山中一药业有限公司，批号W00003M）和自制橘红颗粒样品，都检测出了11个峰，阴性样品色谱在与供试品色谱11个峰相应位置上均未有色谱峰出现，无干扰。提示供试品色谱中的11个特征峰为橘红颗粒物质成分的反应，为特征峰，该方法具有较好的专属性。

2.5精密度试验

取“2.2.2”项下的橘红颗粒供试品溶液，按“2.1”试验条件，连续进针5次，进行测定，分析并计算11个特征峰的相对保留时间及相对峰面积。表2为橘红颗粒精密度试验共有峰的相对保留时间，相对保留时间的RSD为0.00%～0.50%，表3为橘红颗粒精密度试验共有峰的相对峰面积，其相对峰面积的RSD为0.00%～2.83%。结果表明仪器等整个检测系统的精密度良好，符合特征图谱的要求。

2.6稳定性试验

取“2.2.2”项下的橘红颗粒供试品溶液，按“2.1”试验条件，分别在0、4、8、16、24 h测定。分析并计算11个特征峰的相对保留时间及相对峰面积。表4为橘红颗粒稳定性试验共有峰的相对保留时间，相对保留时间的RSD为0.00%～0.71%，表5为橘红颗粒稳定性试验共有峰的相对峰面积，其相对峰面积的RSD为0.00%～3.51%。结果表明，在24 h内橘红颗粒的图谱基本稳定，没有明显的变化，符合特征图谱的要求。

2.7重复性试验

同一橘红颗粒供试品粉末（广州白云山中一药业有限公司，批号W00003M），取6份，精密称定，按“2.2.2”制备供试品溶液，按“2.1”试验条件，平行测定6份。分析并计算11个特征峰的相对保留时间及相对峰面积。表6为橘红颗粒重复性试验共有峰的相对保留时间，相对保留时间的RSD为0.00%～0.72%，表7为橘红颗粒重复性试验共有峰的相对峰面积，其相对峰面积的RSD为0.00%～3.45%。结果表明同一批次的6 份供试品色谱相似，没有明显的差异，方法的重复性良好，符合特征图谱的要求。

2.8特征峰归属性试验

按照《中国药典》[1]‘橘红颗粒处方和制剂，选取相应的对照药材分别制成15味药材样品（水煎煮，浓缩为浸膏）。再按“2.2.2”制备对照药材溶液，按“2.1”试验条件，分别进样测定。采用橘红颗粒样品特征图谱与15味对照药材图谱比较，找出特征峰归属。另外根据归属药材具有的主要成分，配制不同的对照品溶液并测定，各特征峰归属信息见表8，结果确认峰7为参照物柚皮苷、峰5为甘草苷，峰9为橙皮苷。

2.9特征图谱的建立

按“2.2.2”供试品溶液制备和“2.1”试验条件，对2018年四川省评价性抽验项目橘红颗粒198批样品进行特征图谱的采样及分析。由于不同样品特征峰面积相差较大，仅对保留时间进行了计算及分析。按照相对保留时间±5%的原则计算和分析。结果显示：198批次橘红颗粒中，14批次样品有峰缺失，均为5号甘草苷峰缺失，其余184批次样品均具有11个特征峰（表9、图5）。占样品量的92.93%，其11个特征峰的相对保留时间RSD为0.00%～0.82%（不同企业的样品色谱中，11个特征峰中参照峰S对应的柚皮苷占80%以上，由于受生产工艺、投料药材质量等许多因素影响，11个峰的面积变化较大，与S峰比较，其相对面积没有规律性，因此没有对11个特征峰的相对面积作出统计分析）。结合专属性、重复性和稳定性的结果，建立橘红颗粒特征图谱。特征图谱具有11个特征峰;其中7号峰为参照物柚皮苷S峰，5号峰为甘草苷，9号峰为橙皮苷;11个特征峰与相应的S峰比较，其相对保留时间规定值为：0.277（峰1）、0.330（峰2）、0.463（峰3）、0.519（峰4）、0.787（峰5）、0.934（峰6）、1.000（峰7（S））、1.018（峰8）、1.029（峰9）、1.176（峰10）、1.303（峰11），相对保留时间都应在规定值的±5%之内，符合要求。

3讨论

按照中国药典及相关文献[14-20]，结合橘红颗粒的制法以及处方中化橘红、陈皮、甘草等多味药材的含量测定方法，在供试品的提取方法上，考察了水、甲醇和乙醇不同溶剂超声提取，结果表明，各提取方法得到的液相色譜差异不大，其中甲醇处理的色谱图，基线最平整;在超声时间上，以君药化橘红的主成分柚皮苷，也就是特征图谱中最大峰面积S峰为考察指标，超声处理15、30和45 min，其中30 min就基本达到最高值了，最后确定供试品溶液的制备以“2.2.2”试验条件为最好。流动相的选择上，考察了甲醇-水（梯度洗脱）、乙腈-水（梯度洗脱），其中甲醇-水基线噪音比较大，不够平稳，甘草苷成分分离效果不理想;在波长选择上，考察了207、237 nm和283 nm，其中207 nm靠近末端吸收，基线噪音比较大，而283 nm为柚皮苷和橙皮苷的最大吸收峰，同时也具有甘草苷237 nm的吸收效果，选择283 nm最为理想，最后确定本研究的试验条件最好，其特征峰较多，分离效果好，基线噪音小。在测定仪器方面，以Anilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦公司）建立方法并测定样品，以Waters 2695-2487高效液相色谱仪（Waters公司）验证其仪器选择性，结果提示其重现性良好。

橘红颗粒药味多，成分复杂，采用特征图谱来反映并评价其质量是一种比较有效的手段，其优点在于可以较为全面地反映不同药味的化学成分，表征制剂质量。本研究建立的橘红颗粒特征图谱，可以归属处方中的7味药材。本研究测定不同企业生产的198批橘红颗粒，结果显示，14批次样品有峰缺失，主要是5号甘草苷峰缺失，占测定样品的7.1%。橘红颗粒药味多，现行质量标准缺少多味药材的鉴别，投料药材产地不同，批次不同，其质量相差很大，如果把控出现漏洞，就会给部分产品带来质量安全隐患。

综上所述，本研究建立的橘红颗粒特征图谱检测法专属性强，重复性好，简便快速，可有效鉴别和评价橘红颗粒的质量优劣，用于橘红颗粒的质量控制，方法可行。

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（收稿日期：2019-07-08  本文编辑：孟庆卿）