大白菜对氮素响应的基因型差异及相关特征分析

陈亚男，吕晓惠，丁 谦，郑 晗，杨 宁，宋晴晴，王俊峰，李景娟，高建伟

(1.山东师范大学 生命科学学院，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院 蔬菜花卉研究所，山东省设施蔬菜生物学重点实验室，国家蔬菜改良中心山东分中心，山东 济南 250100；3.潍坊市工程职业学院 花卉学院，山东 青州 262500)

目前，我国是世界上最大的蔬菜生产国和消费国，国家统计局数据显示，2017年我国蔬菜播种面积为1 953.33万hm2，总产量约为7.98亿t。蔬菜是一种通过大水大肥进行田间管理的作物，过量施用化肥的现象普遍存在。过量施肥，加上长期连作重茬等问题，导致蔬菜地理化性状和生物学环境不断恶化，蔬菜产品质量逐年下降，效益降低。如何在保证蔬菜产量的情况下减少化肥施用量，是我国蔬菜产业健康发展过程中急需解决的重要问题。

氮素是作物生长发育必需的大量元素之一，是氨基酸、蛋白质、核酸、叶绿素、酶及多种维生素的主要组成成分，直接影响作物体内叶绿素、蛋白质、可溶性糖等的含量和性状，进而影响其产量和品质。施用氮肥可以有效地提高作物产量，但是过多施用氮肥会造成氮肥利用效率低下、生产成本增加、环境污染等问题。据报道，目前我国氮肥的利用率只有30%～35%[1]，过量氮肥通过土壤淋溶到废水中或大气中形成氧化亚氮和氮气，加剧了水体富营养化和土壤酸化，导致农田土壤质量不断下降，生态环境破坏严重[2-3]。研究表明，水稻[4]、小麦[5]、玉米[6-7]和马铃薯[8]等作物对氮素的吸收和利用存在显著的基因型差异，筛选氮高效种质资源，培育氮高效作物新品种，是提高氮肥利用效率、减轻氮肥导致的环境污染的有效措施。

大白菜起源于中国，是我国栽培面积和生产供应数量最大的蔬菜作物，在我国蔬菜周年生产、周年供应和稳定市场等方面起着重要作用。大白菜作为叶菜，其生产过程中需要投入大量的氮肥。此外，大白菜也是一种容易积累硝酸盐的蔬菜，养分过剩导致叶片中硝酸盐累积过多，硝酸盐代谢过程中产生的一氧化氮和亚硝基化合物对人体健康不利[9]。近年来，科学家对施氮量及施用方式对大白菜产量、品质等经济性状的影响进行了一定的研究。研究结果表明，不同氮肥施用量和施用方式对大白菜的经济性状具有重要影响，并非施氮量越高其产量和品质越好，过度施氮反而会导致大白菜产量和品质的下降[10-16]。不同大白菜品种的产量、品质及其他农艺性状对氮素的响应存在基因型差异[13,15,17]。目前为止，对大白菜响应氮素基因型差异、相关特征及氮效率类型的划分尚缺乏系统研究与分析。因此，本研究以大白菜主产区的68个大白菜主推品种为试验材料，对其在正常供氮和低氮条件下的主要农艺性状及氮效率性状进行了详细的调查，对其主要农艺性状对氮素响应的特征及基因型差异进行了系统分析，并对大白菜品种的氮效率类型和氮敏感度进行了划分，为大白菜氮高效品种的选育、大白菜氮效率类型评价机制的完善及研究大白菜对氮素响应的分子机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料为目前大白菜主产区(山东、北京、天津等地区)市场上主推的大白菜品种，共68份，由山东省农业科学院蔬菜花卉研究所、浙江农业科学院蔬菜花卉研究所、青岛市农业科学研究院、山东鲁蔬种业股份有限公司、山东登海种业股份有限公司、青岛胶研种苗有限公司、德高蔬菜种苗研究所等多家单位提供。

1.2 试验土壤概况

为降低土壤中累积氮元素对本试验的影响，于当年夏季在不施氮肥的情况下种植玉米以吸收土壤中累积的氮元素。在开展本试验前，采用常规农化分析方法对试验地土壤大量元素进行了测定[18]，20 cm耕层土壤中全氮含量为0.62 g/kg，碱解氮为7.96 mg/kg，速效磷为12.80 mg/kg，速效钾为132.16 mg/kg，为中低肥力条件。土壤本底氮元素含量低，适合本研究需要。

1.3 试验设计

试验于2017年8月15日在山东省农业科学院蔬菜花卉研究所长清试验基地进行，以尿素(N：46%)为氮源，设置正常供氮(N：270 kg/hm2)和低氮(N：54 kg /hm2)2种处理，于播种前一次性施入。播种前施足磷肥和钾肥，磷肥为过磷酸钙(P2O5：150 kg/hm2)，钾肥为硫酸钾(K2O：270 kg/hm2)。每个材料随机种植一行，行距60 cm，株距50 cm，每行10株。每种处理设3个重复。于采收期在每个重复中各选择1株代表性植株进行性状调查。

1.4 指标测定及计算方法

农艺学性状的调查：于成熟期对开展度、株高、毛质量、外叶数、球质量、球高、球宽、球叶数、最大叶长、最大叶宽、中肋长、中肋宽、中肋厚、中心柱长、中心柱宽共15个农艺性状进行详细调查，其调查方法和标准参考《中国大白菜育种学》附录4[19]。

含氮量：沿叶球纵中心轴纵切取约1 cm厚叶片，105 ℃杀青30 min后，75 ℃烘干至恒质量，粉碎后用Kjeltec Auto Analyzer 1030 凯氏定氮仪测定其含氮量。

氮效率：即氮素农学利用效率，为单位施氮量所产生大白菜的球质量，即叶球产量与施氮量之比(g/g)[20]。

氮响应度：为(正常氮水平下产量-低氮水平下产量)/(正常水平下施氮量-低氮水平下施氮量)，单位为g/kg。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 13.0软件对本试验所得数据进行计算及分析。

2 结果与分析

2.1 不同施氮条件下大白菜农艺性状的差异分析

不同施氮量对大白菜农艺性状有明显影响，一般而言，随着施氮量的增加，各个性状的指标值也随之增加。例如毛质量在低氮条件下的变异范围为1.40～4.55 kg，平均值为2.79 kg，而在正常供氮条件下，变异范围为1.57～5.17 kg，平均值为3.56 kg；球质量在低氮条件下变异范围为0.65～3.19 kg，平均值为1.84 kg，而在正常供氮条件下，变异范围为1.02～3.69，平均值为2.42 kg；株高在低氮条件下的平均值为31.50 cm，而在正常供氮条件下为35.90 cm(表1)。

不同基因型大白菜在2种处理条件下的变异幅度都较大。变异系数可以衡量品种间各个性状的变异程度。变异系数越大，表明性状在品种间的差异越明显。低氮条件下各性状的变异系数为9.35%～36.62%，正常供氮条件为9.29%～34.01%。无论在低氮还是正常供氮条件下，中心柱长的变异系数在所有调查的性状中都是最大的，在低氮条件下的变异范围为2.53～12.06 cm，变异系数为36.62%；在高氮条件下的变异范围为2.55～11.27 cm，变异系数为34.01%。毛质量和球质量在2种处理条件下的变异系数也较大，低氮条件下分别为23.30%和26.09%，正常供氮条件下分别为20.51%和20.25%。而中心柱宽和开展度在2种氮处理条件下的变异系数都较小，低氮条件下分别为10.44%和9.35%，正常供氮条件下分别为9.29%和11.94%(表1)。

表1 不同供氮条件下供试大白菜品种重要性状的差异

注：*.在0.05水平上的差异显著性；**.在0.01水平上的差异显著性。表2,4,5同。

Note：*.Significant difference at the level of 0.05;**.Significant difference at the level of 0.01.The same as Tab.2,4,5.

双因素方差分析结果表明，除外叶数和中心柱长在不同氮水平之间差异不显著外，开展度、株高、毛质量、球质量等其他13个农艺性状受供氮水平的影响均存在极显著差异(P<0.01)；不同基因型大白菜品种的各个性状在相同氮处理条件下的差异均达到了极显著水平(P<0.01)；品种×处理间，中心柱长没有显著性差异，外叶数和中肋宽的差异达到了显著水平(P<0.05)，开展度、株高、毛质量、球质量等其他12个性状之间均存在极显著差异(P<0.01)(表1)。

综上所述，大白菜绝大多数性状同时受到氮水平和基因型的双重影响，无论是在品种间、基因型间还是在品种×处理间，均有显著性差异(P<0.05)(表1)。中心柱长度和外叶数在氮处理之间没有显著性差异，说明这2个性状受氮水平影响不大。中心柱长在品种×处理间差异也不显著。而无论是在低氮还是在正常供氮条件下，中心柱长在品种间的差异均达到极显著水平，且变异系数最大(表1)。中心柱长是衡量大白菜耐抽薹性的重要指标，说明氮处理不会影响大白菜的耐抽薹性，其主要受基因型的影响。

2.2 不同施氮条件下大白菜产量相关性状与其他农艺性状的相关性分析

对大白菜产量相关性状(毛质量、球质量、球高、球宽和球叶数)在不同氮处理条件下与其他农艺性状的相关性进行了分析。如表2所示，在2种氮水平下，大白菜毛质量除了与球叶数和中心柱长没有显著相关性外，与其他农艺性状都有显著或极显著的正相关关系(P<0.05或P<0.01)。球质量与球高、球宽、开展度、株高、最大叶长、最大叶宽、中肋宽、中肋厚和中心柱宽在2种氮处理条件下均呈极显著正相关(P<0.01)。在正常供氮条件下，球质量与中肋长具有极显著正相关关系(P<0.01)，而在低氮条件下则没有显著相关性。在2种氮水平下，球高与开展度、株高、最大叶长和中肋长都具有显著或极显著正相关关系，与中心柱长则呈显著或极显著负相关(P<0.05或P<0.01)，与球宽、球叶数、外叶数、最大叶宽、中肋宽和中心柱宽没有显著相关性。球高与中肋厚在正常供氮条件下没有显著相关性，在低氮条件下则呈显著正相关(P<0.05)。球宽在2种供氮条件下均与开展度、外叶数、最大叶宽、中肋宽、中肋厚和中心柱宽呈显著或极显著正相关(P<0.05或P<0.01)，与球叶数、株高和最大叶长均没有显著相关性；在正常供氮条件与中心柱长呈显著正相关(P<0.05)，在低氮条件下则没有显著相关性；在低氮条件下与中肋长具有显著负相关性(P<0.05)，在正常氮条件下则没有显著相关性。在2种供氮水平下，球叶数与开展度、株高、外叶数、最大叶长、最大叶宽、中肋长和中肋宽均没有显著相关性，与中肋厚和中心柱长均呈显著或极显著负相关(P<0.05或P<0.01)；在正常供氮条件下球叶数与中心柱宽具有显著正相关性(P<0.05)，在低氮条件下则没有显著相关性(表2)。

表2 不同供氮条件下大白菜产量相关性状与其他农艺性状间的相关性分析

由上述分析结果可知，大白菜产量相关性状与绝大多数其他农艺性状在2种氮处理条件下具有相似的相关关系，如产量性状与开展度、株高、外叶数、最大叶长、最大叶宽和中肋宽的相关性(表2)；个别农艺性状与产量性状的相关性在2种氮水平下有所不同，如球质量与中肋长、球高与中肋厚、球宽与中肋长和中心柱长、球叶数与中心柱宽等(表2)，可能与氮处理密切相关。

2.3 氮处理对不同基因型大白菜农艺性状的影响

利用农艺性状的相对值，即正常供氮与低氮条件下的差值比上正常供氮条件下的数值，来衡量氮处理对大白菜农艺性状的影响。由表3可知，大白菜大多数农艺性状的群体相对平均值均为正值(除相对外叶数的群体平均值为负值外)，说明绝大多数农艺性状受低氮的影响而降低，外叶数增加可能与低氮条件下结球性降低有关。其中相对球质量和相对毛质量的群体平均值最大，其次为相对株高、相对中肋厚和相对中肋长，相对外叶数、相对开展度和相对中心柱长的群体平均值较小(表3)，说明低氮处理对大白菜重量性状的影响最大，高度相关性状次之，对外叶数、开展度、和中心柱等形态和抽薹性相关性状的影响较小。

表3 大白菜15个农艺性状的相对值((正常氮-低氮)/高氮)

不同基因型间各农艺性状的相对值变异范围较大，例如，相对球质量的变异范围为-0.412～0.617，相对毛质量的变异范围为-0.269～0.549。用变异系数衡量品种间各性状相对值的变异程度，结果表明，相对外叶数和相对中心柱长的变异系数最大，相对毛质量和相对球质量的变异系数最小，说明外叶数和中心柱等性状在基因型间对低氮的响应差异较大，毛质量和球质量等产量性状在基因型间对低氮的响应差异较小。

2.4 不同施氮条件下大白菜含氮量、氮效率及氮响应度

双因素分析结果表明，大白菜含氮量和氮效率在不同氮处理间、基因型间、品种×处理间都存在极显著差异(P<0.01)(表4)。正常氮条件下大白菜的含氮量(范围：3.40%～5.16%，平均值：4.07%)明显高于低氮条件下的含氮量(范围：2.66%～4.17%，平均值：3.35%)，而正常氮条件下的氮效率(范围：0.15～0.55 g/g，平均值：0.36 g/g)却明显低于低氮条件下的氮效率(范围：0.48～2.36 g/g，平均值：1.37 g/g)。不同基因型间含氮量、氮效率和氮响应度的变异幅度都较大，其中氮响应度的变异系数最大(96.32%)，其次为氮效率(正常氮：20.17%；低氮：25.94%)，含氮量的变异系数最小(正常氮：9.58%；低氮：10.45%)，不同处理之间相同性状的变异系数差别不大(表4)。

上述分析结果表明，低氮可降低大白菜的含氮量，提高氮效率；不同基因型间含氮量、氮效率和氮响应度差异显著，其中氮响应度的变异系数最大；不同处理之间相同性状的变异系数差别不大。

表4 不同施氮条件下大白菜含氮量、氮效率及氮响应度

2.5 不同施氮条件下大白菜含氮量、氮效率及氮响应度与农艺性状的相关性分析

相关性分析表明，含氮量在正常供氮条件下与外叶数、最大叶宽和中肋宽具有显著或极显著负相关关系(P<0.05或P<0.01)，在低氮条件下仅与外叶数显著负相关(P<0.05)(表5)。无论是在正常供氮还是在低氮条件下，氮效率与外叶数、球叶数和中心柱长均没有显著相关性，与开展度、株高、毛质量、球质量、球高、球宽、最大叶长、最大叶宽、中肋宽、中肋厚和中心柱宽均呈极显著正相关(P<0.01)；氮效率在正常供氮条件下与中肋长极显著正相关(P<0.01)，在低氮条件下则没有显著相关性。氮响应度在高氮条件下除与外叶数、球叶数、和中心柱长没有显著相关性外，与其他性状的相关性均达到了显著正相关水平(P<0.05)；而在低氮条件下，氮响应度与毛质量、球质量、球宽、最大叶宽、中肋宽和中心柱宽具有显著或极显著负相关关系(P<0.05或P<0.01)，与其他性状的相关性不显著(表5)。

综上所述，无论是在低氮还是在高氮条件下，含氮量仅与少数几个农艺性状具有显著或极显著负相关关系(P<0.05或P<0.01)，与大多数农艺性状没有显著相关性；氮效率与大多数农艺性状在2种氮处理条件下都呈极显著正相关(P<0.01)；氮响应度与农艺性状的相关性在2种氮处理条件下完全不同，在高氮条件下与多数性状显著或极显著正相关，而在低氮条件下仅与少数性状显著负相关(P<0.05或P<0.01)。

2.6 不同基因型大白菜氮效率和氮敏感度的评价和划分

将球质量高于群体平均值以上的大白菜品种划分为氮素高效型，低于平均值以下的归为氮素低效型。据此原则，将本研究中68份大白菜品种划分为4种类型(图1、表6)：(Ⅰ)双高效型(Nitrogen efficient under the two nitrogen conditions，NET)，在2种供氮条件下的球质量均高于群体平均值的大白菜品种，包括丰抗78、青研春白1号和德高青华76等18个大白菜品种；(Ⅱ)低氮高效型(Nitrogen efficient under the low nitrogen condition，NEL)，在正常供氮条件下球质量低于群体平均值，而在低氮条件下高于群体平均值的大白菜品种，主要包括改良青杂三、丰抗58和牛早秋1号等15个大白菜品种；(Ⅲ)高氮高效型(Nitrogen efficient under the normal nitrogen condition，NEN)，在正常供氮条件下球质量高于群体平均值，在低氮条件下低于群体平均值的材料，主要有山东6号、青研春白4号、西白3号等13个品种；(Ⅳ)双低效型(Nitrogen inefficient under the two nitrogen conditions，NIT)，在2种供氮条件下球质量均低于群体平均值的品种，有西白70、金童玉女和德高8号等22个品种(表6)。

表5 不同施氮条件下大白菜氮效率相关性状与农艺性状的相关性系数

Ⅰ.双高效型；Ⅱ.低氮高效型；Ⅲ.高氮高效型；Ⅳ.双低效型。

相对球质量和氮响应度可衡量大白菜对氮的敏感程度，相对球质量和氮响应度越接近于0，氮敏感度越低，反之氮敏感度越高。进一步根据正常供氮和低氮条件下的相对球质量和氮响应度，将不同基因型大白菜的氮敏感度划分为4种类型(图2、表6)：(Ⅰ)将相对球质量绝对值≤0.20、氮响应度绝对值≤0.03的大白菜品种划分为氮不敏感型品种(Nitrogen insensitive type，NIS)；(Ⅱ)将相对球质量绝对值≤0.40、氮响应度绝对值≤0.06范围内去除Ⅰ类型品种后的材料划分为氮轻度敏感型品种(Nitrogen low sensitive type，NLS)；(Ⅲ)将相对球质量绝对值≤0.60、氮响应度绝对值≤0.09范围内去除Ⅰ和Ⅱ类品种后的材料划分为氮中度敏感型品种(Nitrogen medium sensitive type，NMS)；(Ⅳ)将相对球质量绝对值>0.60或氮响应度绝对值>0.09的划分为氮高度敏感型品种(Nitrogen high sensitive type，NHS)。据此原则，本试验研究的68份大白菜品种中，有23份为氮不敏感型品种，包括87-114、德高春、丰抗78、秋白19和桔红62等；有24份为氮低度敏感型材料，这类材料包括天津青麻叶、小杂56、西白9号和山东4号等品种；有13份为氮中度敏感性材料，包括改良青杂三、鲁白3号和西白45等品种；有8份为氮高度敏感性材料，包括西白3号、西白68、山东6号和青研春白4号等大白菜品种(表6)。

表6 不同基因型大白菜氮效率类型及氮敏感度的划分

Ⅰ.氮不敏感型；Ⅱ.氮低度敏感型；Ⅲ.氮中度敏感型；Ⅳ.氮高度敏感型。

3 讨论

3.1 供氮水平对大白菜重要农艺性状和氮效率性状的影响

氮素是影响植物生长发育各项指标的重要营养元素。目前，对供氮水平对水稻[4]、小麦[5]、玉米[6-7]等粮食作物的重要农艺性状的影响研究较为详细，对蔬菜特别是叶菜类蔬菜的研究相对较少。在白菜中，对产量和品质性状对氮素的响应研究较多[10-13,16]，对其他重要农艺性状对氮素的响应尚缺乏系统调查和分析。本研究以大白菜主产区的68份代表性大白菜品种为试验材料，对包括产量在内的15个在生产中关注的重要农艺性状响应氮素水平的特征进行了系统调查和分析，分析结果表明，除外叶数和中心柱长在不同氮水平之间差异不显著外，毛质量、球质量、球高等其他13个农艺性状均存在极显著差异(P<0.01)。氮水平对大白菜毛质量、球质量等性状的影响最大，对开展度和中心柱等形态和抽薹性相关的性状影响最小，说明施氮量对大白菜产量性状至关重要，研究大白菜对氮素的吸收利用对大白菜生产实践具有重要意义，而形态和抽薹性等性状可能主要受基因型的调控，与施氮量无关。

大白菜的含氮量和氮农学利用效率在不同氮处理条件下也存在显著差异，施氮量越高，含氮量越高，氮利用效率越低，与在其他作物中的研究结果一致[4-8]，因此,合理施氮是提高大白菜氮素利用效率的有效途径之一。

3.2 大白菜对氮素响应的基因型差异

在水稻、玉米和小麦等重要作物中的研究结果表明，不同作物品种对氮素的响应存在显著的基因型差异，可以通过遗传改良的手段提高作物对氮素的吸收利用效率，筛选氮高效种质资源进而培育氮高效作物新品种是提高作物对氮素高效吸收利用的有效途径[4-8]。大白菜对氮素响应的基因型差异目前也有了一定的研究，但都是针对少数材料个别性状的调查和分析[13,15,17]，仍需进行详细系统地研究。本研究中，笔者对大白菜主产区的主推品种进行了广泛搜集，对68份典型主推品种在2种氮水平下的基因型差异进行了详细调查和系统分析，研究结果表明，在2种氮处理条件下，大白菜的15个重要农艺性状在基因型间都存在极显著差异(P<0.01)，其中中心柱长在基因型间的差异最明显，其次为毛质量和球质量等重量性状，说明大白菜的重量性状和抽薹性都明显受到基因型的影响。除中心柱长外，大白菜的其他14个农艺性状同时受到供氮水平和基因型的双重调控，而中心柱长只受基因型的调控。大白菜的3个氮效率性状也存在显著的基因型差异，说明通过遗传改良手段提高大白菜对氮素的高效利用是可行的。

3.3 不同大白菜品种氮效率类型和氮敏感程度的评价和划分

在其他作物中，一般根据不同氮水平下的产量对作物氮效率进行评价和划分[5,21]。本研究中，笔者也根据不同氮水平下大白菜的产量对大白菜的氮效率类型进行了分类，将68个大白菜品种分成了4种类型。另外，笔者还根据正常供氮条件下与低氮条件下的相对产量和氮响应度，对大白菜品种的氮敏感程度进行了划分，本研究中的68个大白菜品种可分成4种类型。结合以上2种评价标准，将能更清楚地了解不同大白菜品种的氮素响应特征，为大白菜生产实践提供有效的参考，也为进一步研究大白菜氮素响应的分子调控机制提供基因型资源。

施氮水平对大白菜重量相关性状的影响最大，对抽薹性相关的性状影响最小；低氮处理可降低大白菜球叶含氮量，提高氮利用效率；不同大白菜品种对氮素的响应存在显著的基因型差异；根据不同氮水平下大白菜的产量，将供试大白菜品种分为双高效、高氮高效、低氮高效和双低效4种氮效率类型；根据相对产量和氮响应度，供试大白菜品种可分为不敏感、低度敏感、中度敏感和高度敏感4种氮敏感型；综合氮效率类型和氮敏感度类型2种评价标准，可更清楚了解不同大白菜品种的氮素响应特征，为大白菜生产实践及响应氮素胁迫的分子生物学研究奠定基础。