基于局域表面等离子体共振(LSPR)的核酸适配体筛选新方法的建立

郝俊芳，张英涛，邢广旭，王方雨

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州450002；2.四川农业大学 动物医学院禽病研究中心，四川 成都611130；3.河南省科学院 生物研究所有限责任公司，河南 郑州450008)

核酸适配体指具有特定三维空间结构的单链寡核苷酸(DNA或RNA)，它能够与多种靶标物结合[1]，包括离子、小分子、蛋白质和完整的活细胞等[2-4]。与体内天然的抗体相比，适配体可以化学合成并具有许多优点，如分子质量小、免疫原性低、不依赖于动物或细胞并且可以进行多种修饰，被称为化学抗体[5-7]。鉴于适配体优越的性能，其已作为一种新型的生物识别工具,在药物残留、疾病诊断、食品安全和分析化学等领域的研究备受关注[8-11]。然而，由于适配体筛选过程的繁琐性，使得适配体的可用数量非常有限。因此，解决各种靶标的高效筛选问题是加速核酸适配体广泛应用的关键步骤。

核酸适配体筛选过程是利用体外筛选技术——指数富集的配基系统进化技术(SELEX)，从随机核酸小分子组合文库中筛选出靶标适配体的一个分离和扩增的迭代过程[12-14]。目前，核酸适配体已经发展多种筛选方法，包括硝酸纤维素膜-SELEX、磁珠-SELEX、微流控-SELEX和毛细管电泳-SELEX[14]。传统的SELEX主要缺点是筛选过程繁琐、耗时耗力、重复性差，往往需要多轮筛选才能得到高亲和力的适配体，制约了适配体的开发和应用[15-16]。目前，适配体筛选无法实现实时在线自动化监测，且针对不同靶标类型没有标准化的程序。如何高效率的分离出具有高亲和性和特异性的适配体是目前研究的热点，也是适配体发展面临的主要问题。

局域表面等离子体共振(LSPR)是一种新型的分析工具，主要用于分析大小分子之间的相互作用，如蛋白质与小分子药物、蛋白质与核酸等[17-18]。LSPR的纳米金芯片具有独特的化学和光学性质[19]，在可见光范围内产生强烈的共振吸收峰，使得金纳米粒子周围的局部折射率高度敏感[20]。传感器芯片上的纳米金粒子(AuNPs 1.5 mm2)小于LSPR的连续金膜，可以通过EDC/NHS法将靶标分子固定在芯片表面。LSPR最显著的优势在于样品无需进行任何标记即可实时在线监测，具有操作简便和重复性好等优点[21]。LSPR用于测定亲和力的研究已有报道[22-23]。基于LSPR的技术优势，以链霉亲和素(SA)传感器芯片作为固定靶标，通过测定流过芯片表面不同浓度的核酸文库来分析SA结合的适配体(SBA)的亲和力，以期为核酸适配体的快速筛选提供新的途径。

1 材料和方法

1.1 材料

ssDNA初始文库(L2)和上下游引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，具体序列见表1；Open LSPR和亲和素传感器芯片购自北京普瑞麦迪公司；毛细管电泳(CE)G7100A plus和熔融石英毛细管购自美国Agilent Technologies公司；链霉亲和素购自上海普欣公司；牛血清白蛋白(BSA)购自北京百奥莱博公司；PremixTaq和pMD19-T Vector购自大连宝生物公司；胶回收试剂盒和PCR纯化试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司。所有用于LSPR和CE分析的溶液使用前均需经0.22 μm的滤器过滤。

表1 L2库、P1和P2引物的序列Tab.1 The sequence of L2 library,P1 and P2 primers

1.2 方法

采用LSPR-SELEX技术筛选核酸适配体的流程见图1。首先，将吸附在LSPR芯片上的核酸文库洗脱收集。其次，将其进行PCR扩增富集并作为二级文库，直至筛选出高亲和力的适配体。随后，经细菌克隆、测序和化学合成得到SBA适配体。最后，通过毛细管电泳鉴定LSPR-SELEX筛选得到的SBA。

1.2.1 LSPR-SELEX技术筛选SA的适配体 首先，将ssDNA初始文库(L2)进行变性处理。取ssDNA干粉用ddH2O溶解并稀释至100 μmol/L。经95 ℃条件下水浴10 min破坏核酸分子间形成的聚合物，然后冰浴10 min，-20 ℃保存。其次，在LSPR开始之前将运行缓冲液PBS(10 mmol/L)以150 μL/min的流速运行约10 min，直至信号达到稳定基线。接着，将ssDNA溶液按预先设计好的浓度用PBS进行稀释，并且每个样品取250 μL注射到仪器，以20 μL/min的流速与芯片相互作用5 min。然后，以150 μL/min的流速冲洗芯片5 min用于冲洗未结合或结合力弱的ssDNA分子。最后注入250 μL解离缓冲液NaOH(10 mmol/L)，以20 μL/min的流速洗脱并收集特异性结合SA的适配体。在每轮筛选后，使用Trace Drawer数据软件分析其KD值。

1.2.2 PCR扩增和单链DNA的制备 将洗脱和收集的ssDNA分子作为二级文库进行PCR扩增富集。优化后的50 μL反应体系：20 μmol/L的P1、P2各2 μL，rTaq和ssDNA文库分别为25 μL和21 μL。PCR程序：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，61.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后，72 ℃延伸2 min。通过2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，并切胶回收用作模板以制备单链二级文库。

不对称PCR优化后的反应体系：20 μmol/L的P2 4 μL，25 μL的rTaq，模板2 μL，最后ddH2O补充至50 μL。以纯化后的产物为模板制备单链二级文库。

1.2.3 毛细管电泳验证 LSPR-SELEX筛选的核酸适配体通过毛细管电泳表征。仪器运行之前，依次用不同的溶液(1 mol/L NaOH、ddH2O、40 mmol/L Tris-乙酸盐)在300 s×1 Bar的压力脉冲下，预冲洗毛细管柱5 min。注入条件为50 mBar×20 s，时间为0.2 min×20 kV。样品瓶分别装入SA、SBA、SA+SBA复合物(室温孵育30 min)、BSA以及BSA+SBA复合物，每个样品不小于200 μL，压力进样50 mBar×10 s，分离电压20 kV，分离时间20 min，使用488 nm氩离子激光器激发荧光。运行结束后，毛细管用1 mol/L NaOH和ddH2O各冲洗10 min。

2 结果与分析

2.1 LSPR-SELEX技术筛选SA的适配体

ssDNA初始文库(L2)长度为114 nt，中间部分为74 nt的随机序列，两端的侧翼为20 nt引物位点。在第1轮LSPR-SELEX(图2A)中，筛选到与SA结合的适配体SBA(命名为SBA-1)，其KD值为107 μmol/L (表2)。在第2轮LSPR-SELEX(图2B)中，SBA(命名为SBA-2)的KD值为98 nmol/L(表2)。LSPR-SELEX的结果表明，LSPR-SELEX技术在2轮的筛选中使SBA的亲和力提高了1 000倍，获得纳摩尔范围内的适配体，将筛选到与SA结合的适配体命名为SBA。

A：第1轮LSPR-SELEX筛选SBA时得到的动力学曲线；B：第2轮LSPR-SELEX筛选SBA时得到的动力学曲线A:The kinetic curve obtained in the first round of LSPR-SELEX screening for SBA;B:The kinetic curve obtained in the second round of LSPR-SELEX screening for SBA图2 通过LSPR-SELEX技术分析L2与SA结合的动力学曲线Fig.2 The dynamic curves of L2 and SA binding analyzed by LSPR-SELEX technology

表2 SBA与SA相互作用的动力学参数Tab.2 The kinetic parameters of SBA-SA interaction

2.2 毛细管电泳验证

游离溶液中天然结构的维持有利于靶标和核酸文库的相互作用。因此，在游离溶液中分离靶标-适配体结合物是最理想的方法。目前，仅有CE可以在游离溶液中实现适配体的高效筛选[24]。基于CE的特性，验证经LSPR-SELEX筛选得到的SBA，以BSA作为对照。

CE的结果表明,SBA和SA的样品峰分别出现在11.37 min和6.98 min，与预期的时间相一致；与对照组相比(图3D—图3E)，SA + SBA复合物的样品峰出现在9.32 min，而BSA+SBA复合物的样品峰，分别是位于原来的7.76 min和11.37 min，从而证实了SA与SBA之间的高亲和性和特异性(图3A—图3C)。

2.3 SBA适配体序列

将第2轮收集到的核酸库产物连接到pMD19-T载体上，经转化DH5α感受态细胞、测序等获得了链霉亲和素的核酸适配体SBA序列。由图4可知，SBA适配体的总长度为114 nt，其三维结构为茎环状。

A：SA(250 μg/mL)的毛细管电泳迁移图；B：SBA适配体(150 μg/mL)的毛细管电泳迁移图；C：SBA(75 μg/mL)+ SA(125 μg/mL)的毛细管电泳迁移图；D：BSA(250 μg/mL)的毛细管电泳迁移图；E：BSA(125 μg/mL)+ SBA(75 μg/mL)的毛细管电泳迁移图A:Capillary electrophoresis migration diagram of SA(250 μg/mL);B:Capillary electrophoresis migration diagram of SBA aptamer (150 μg/mL);C:Capillary electrophoresis migration diagram of SBA(75 μg/mL)+SA(125 μg/mL);D:Capillary electrophoresis migration diagram of BSA(250 μg/mL);E:Capillary electrophoresis migration diagram of BSA(125 μg/mL)+SBA(75 μg/mL)图3 毛细管电泳验证SBAFig.3 The SBA verification by capillary electrophoresis

图4 SBA适配体的序列Fig.4 The SBA aptamer sequence

3 结论与讨论

核酸适配体是一段能够与靶标分子高亲和性、高特异性结合的单链寡核苷酸，具有检测灵敏度高、成本低、易合成修饰等优点。其在基础研究、分子诊断以及农产品及农田环境污染监测等诸多领域中展示出广阔的应用前景[25]。目前，随着SELEX技术的快速发展，几十种变体的SELEX已成功地用于开发适配体[26-27]，但大部分SELEX筛选过程较为繁琐、耗时耗力，在一定程度上限制了核酸适配体的开发和应用。

在SELEX筛选过程中，如何快速简便地获取与靶标结合的核酸适配体是提高筛选效率的关键。KIANI等[28]使用链霉亲和素磁珠作为固相载体，将生物素化的地高辛固定在其表面，经过11轮筛选，得到KD值为8.2 nmol/L的地高辛适配体。LUO等[29]通过将CE馏分收集与油封相结合的方法，开发了具有无污染的馏分收集法。研究发现,CE-SELEX不适合筛选小分子靶标的适配体[30]，并且高离子浓度的缓冲体系会影响CE中适配体的稳定性。ZHANG等[31]利用多功能的适配体传感器进行细胞表面多糖的电化学定量和肉眼跟踪活细胞中的糖酵解抑制。LI等[32]使用一种改进的羧基琼脂糖磁珠-SELEX技术，分离出6种针对肺癌标志物的DNA适配体。因此，迫切需要开发一种全新的简便、高效的核酸适配体筛选方法。

与传统SELEX相比，LSPR-SELEX具有以下特征：首先，LSPR-SELEX筛选效率高，大约7 d就可以完成所有的筛选；成本低，传感器芯片可以使用70次以上，并且每轮筛选出的适配体可以通过LSPR的Trace Drawer数据软件精确地计算其KD值。其次，LSPR-SELEX不需要复杂的缓冲液系统，PBS溶液可以极大地保持样品的生物稳定性和活性。最后，LSPR-SELEX不仅可以在短时间内获得高亲和力的适配体，同时可以测定适配体—靶标相互作用的结合参数[19]。重要的是，LSPR-SELEX在整个筛选过程中生物分子无需任何标记，实时在线地监测相互作用，在早期筛选中识别高亲和力的适配体，并对缓冲液的体积、温度和折射率的变化不敏感。本研究开发了一种新的LSPR-SELEX筛选技术，仅用2轮筛选获得了具有纳摩尔平衡解离常数的SBA适配体。CE验证结果表明，筛选出的SBA适配体具有高亲和性和特异性。可见，LSPR-SELEX不仅缩短核酸适配体的筛选周期，而且可以提高SELEX筛选过程的成功率。

随着新型现代农业的发展和生物大分子功能探索的不断深入，对筛选多种不同靶标物的核酸适配体提出了更高的要求，迫切需要一种快速、高效、灵敏度高、操作简便、成本低廉的适配体筛选新方法。虽然SELEX技术目前正在不断完善，但仍有一些技术瓶颈需要去突破。作为新型的分子识别工具，核酸适配体未来在药物、疾病和食品等方面将发挥更加重要的作用。