平菇种质资源的遗传多样性分析

崔 筱,刘 芹,段亚魁，康源春,孔维威,张玉亭,袁瑞奇,孔维丽

(河南省农业科学院 植物营养与资源环境研究所，河南 郑州 450002)

平菇(Pleurotusostreatus)，又名侧耳、糙皮侧耳、蚝菇、黑牡丹菇，台湾又称秀珍菇，在分类学上属真菌门(Eumycota;Mycobionta)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、侧耳科(Pleurotaceae)、侧耳属(Pleurotus)[1]，是一种常见的灰色食用菇。据中国食用菌协会统计(2017年)，国内平菇2016年总产量约600万t，在全国各地均有种植，河南省是全国平菇重点产区，年产量约100万t，栽培面积分布全省。由于不同区域引种混乱，随意命名，导致生产中平菇菌株同名异物和同物异名现象严重。收集生产中常用菌株，对平菇菌株进行有效地分类和鉴定是平菇新品种选育的基础和前提。在自然界中微生物与微生物之间拮抗现象普遍存在，是一个复杂的反应过程，具有防止遗传上明显不同的个体间融合的作用，以保持个体遗传上的稳定性[2]。拮抗反应试验可用于菌株之间亲缘关系远近的预测，在真菌分类学上被广泛应用[3]。但拮抗试验只能将有拮抗反应的菌株分为不同菌株，却不能将没有拮抗反应的菌株视为相同菌株，甚至很难说没有拮抗反应的菌株亲缘关系近，有的不同种或不同属之间的菌株也可能没有拮抗反应，因此，拮抗测定仅仅是菌种鉴定的一种辅助手段，需要和其他鉴定手段相配合。核糖体第1转录间隔区(Internal transcribed spacer 1,ITS1)是位于18S rRNA和5.8S rRNA基因之间的非编码间隔区，在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性，在种间则保持着各种程度的变异，变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近，且具有快速、准确、微量、灵敏度高、程序简单等优点，现已作为一种分子标记广泛应用于真菌的分类鉴定、检测和病害诊断[4-5]。如刘华晶等[6]利用ITS 标记对黑龙江省采集的33个野生黑木耳菌株和8个黑龙江省常见栽培菌株进行遗传多样性分析和系统发育研究。本研究对54个平菇菌种通过拮抗和ITS试验进行了分类和鉴定，旨在为以后的平菇选育工作提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

供试平菇菌株54株，其中野生菌株11株，栽培菌株43株(表1)。A16、A25、A43、A46引自中国农业科学院；A4、A10、A35、A54引自江苏天达食用菌有限公司；A7、A19、A34、A51引自新乡农业科学院；A48引自商丘农业科学院；A20、A24、A29、A31、A40为河南省农业科学院食用菌中心保藏菌株；A27、A49、A50、A52为自育品种。A2、A3、A6、A9、A12、A13、A14、A15、A18、A21、A22为野生型菌株，其余均从生产中采集分离。

1.2 供试培养基

母种PDA培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；栽培培养基：棉籽壳98%、石灰2%。

1.3 试验方法

1.3.1 栽培评价试验 按照配方制作栽培菌袋，菌袋规格为14 cm×28 cm×0.05 cm聚丙烯袋，一端套环，每袋培养料质量500 g，高压灭菌后，在套环一端接种，25 ℃培养，菌丝满袋后，去掉套环，开口出菇，保持棚内温度10～28 ℃、相对湿度 80%～95%、光照150～200 lx、CO2质量浓度1 178.57～1 571.42 mg/m3，子实体七成熟采收，观察记载子实体颜色。

表1 供试平菇菌株Tab.1 The tested strains of Pleurotus ostreatus

1.3.2 拮抗试验 以栽培评价分类的54个平菇菌株为材料，用直径3 mm的打孔器打取各菌株种块于90 mm培养皿内对峙培养，每皿放置8个种块，种块间距1.0 cm，每个菌株重复3次，于25 ℃培养7 d，按照拮抗试验(国家标准)的方法观察菌株间拮抗反应的结果，记录并进行聚类分析。

1.3.3 ITS序列分析

1.3.3.1 DNA的提取与检测 将各参试菌株在相同条件下接种于PDA液体培养基中进行浅层培养，培养量以每个菌株可以做3个平行试验为准。基因组DNA提取方法参考闫燕等[7]的CTAB方法并有一定改动。将5 mm平菇菌块接种到PDA培养基中，于25 ℃、150 r/min恒温振荡培养7 d，7 d后收集菌丝，放入烧过后的洁净研钵中，倒入适量液氮，迅速充分研磨菌丝体直至呈细粉末状，转入EP管。加入600 μL 预热到 65 ℃的CTAB提取液，充分振荡，放入65 ℃水浴锅中1～2 h。在此期间每隔10 min上下颠倒混匀EP管一次，将上述加有菌体粉末的CTAB混合液冷却至室温，然后用V酚∶V氯仿∶V异戊醇=25∶24∶1和V氯仿∶V异戊醇=24∶1的溶液各抽提1次，用DNA 定量仪测定样品DNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20 ℃保存备用。

1.3.3.2 PCR反应引物、体系及程序 ITS1序列PCR扩增正向引物为5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，反向引物为5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′，引物由武汉普奈斯生物科技有限公司合成。PCR反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25～27个循环；72 ℃延伸5 min，使产物延伸完整，4 ℃保存。PCR反应总体系为25 μL，包括5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL，模板DNA 50～100 ng,ddH2O 9.75 μL。

1.3.3.3 DNA序列测定 扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段，用Axygen 凝胶回收试剂盒回收目的片段。在MiSeq机器上利用MiSeq Reagent Kit V3进行2×300 bp的双端测序。

1.3.3.4 ITS序列分析 对测序的54个DNA序列用 Qiime软件进行OTU聚类，将OTU代表序列用Mafft对齐，然后用ClustalX 2.1软件进行序列同源性比较。运用MAGA X软件基于邻接法(Neighbor-joining method,NJ 法)构建分子系统发育树。

2 结果与分析

2.1 平菇栽培评价结果

根据子实体颜色，将54个菌株分为两大类:深灰黑色和灰白色系列，结果见表2、图1—2。

2.2 平菇拮抗试验结果

以颜色分类为基础，分别对2个颜色系列54个菌株做拮抗检测(图3)，共设计拮抗组合1 431组，结果表明，拮抗现象不明显的有47组，占3.28%，初步将31个菌株聚成9个类群，其余23个菌株与其他菌株间拮抗现象比较明显，亲缘关系较远。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ组中，组内各个菌株间没有显著拮抗反应现象，表明这些菌株亲缘关系较近，可能起源于同一菌株，结果见表3。

2.3 ITS序列分析结果

2.3.1 PCR试验结果 54个平菇样品经 PCR 扩增都分别得到约280 bp的目的条带(图4),将测序获得的序列于NCBI 进行在线比对分析，证明其是5.8S rDNA区序列。

表2 供试菌株子实体颜色Tab.2 Fruit body color of tested strains

图1 深灰黑色平菇材料部分出菇试验结果Fig.1 Partial fruiting experiment of dark grey and black varieties

图2 灰白色平菇材料部分出菇试验结果Fig.2 Partial fruiting experiment of grey white varieties

图3 平菇部分拮抗试验结果Fig.3 Partial antagonistic test results of Pleurotus ostreatus

表3 平菇拮抗菌株分组结果
Tab.3 Grouping results ofPleurotusostreatusantagonistic strains

组别Group菌株编号Strainnumber组别Group菌株编号Strainnumber组别Group菌株编号StrainnumberⅠA20A37A41A42A38A54A45ⅤA1ⅧA8ⅡA7A26A17A30A28A32ⅢA10A46A43A11ⅥA16A45A29A53ⅨA25A47ⅦA23A34ⅣA4A31A5A39

M.Marker—1 000、700、500、400、300、200 bp图4 54个平菇样品rDNA ITS1区序列PCR扩增检测结果Fig.4 PCR results of rDNA ITS1 regions of 54 kinds of Pleurotus ostreatus

2.3.2 ITS 序列及组成分析 经对位排列，获得54株菌的ITS序列长度为280 bp，与 GenBank 数据库中平菇菌种的ITS序列相似度为99%以上，在种的水平上证明供试菌株为平菇。经分析可知，54个平菇样品rDNA ITS1序列的碱基组成比较接近(表4)，整个碱基组成中，除A5外，其余53个样品A+T含量均高于C+G含量；单个碱基组成中，除A5外，其余53个样品T含量较高，为31%～33%，C含量较低，为20%～21%。

表4 54个平菇样品rDNA ITS1序列的碱基组成Tab.4 Base composition of rDNA ITS1 sequences of 54 kinds of Pleurotus ostreatus %

2.3.3 分子系统进化分析 为了明确54个平菇样品的分子进化关系，将测序得到的rDNA ITS1序列经ClustalX 2.1软件进行多序列比对重排后，运用MAGA X软件基于NJ法构建平菇rDNA ITS1序列的分子进化系统树(图5)。从系统进化树的数值分析结果可以发现，54个平菇样品可以聚为2个大类，2个大类遗传关系相对较远、独立进化。其中，第一大类中，A33与A13聚为一小类，与A40、A22、A48存在一定的亲缘关系；A42与A20聚为一小类，与A35、A24、A14存在亲缘关系；A47与A29聚为一小类，A10与A11聚为一小类，且两小类之间存在一定的亲缘关系；A38与A5聚为一小类，A37与A4聚为一小类，且两小类之间存在一定的亲缘关系；A44与A12聚为一小类，A21与A9聚为一小类，且这两小类与A18、A6、A15、A3之间存在一定的亲缘关系。第二大类中，A43与A39聚为一小类；A23与A16聚为一小类，A54与A45聚为一小类，A31与A8聚为一小类且与A41存在一定的亲缘关系；A50与A49聚为一小类且与A52、A27、A25存在一定的亲缘关系；A28与A30聚为一小类，A19与A17聚为一小类，且与A32、A53存在一定的亲缘关系；A51与A7聚为一小类，A36与A26聚为一小类，A46与A1聚为一小类，且与A2存在一定的亲缘关系。根据ITS序列进化分析，可将收集到的54株菌种定为36个菌株，彼此之间存在亲缘关系，与初步拮抗试验结果存在一定的差异。

图5 54个平菇菌株的分子系统发育树Fig.5 The molecular phylogenetic tree of 54 strains of Pleurotus ostreatus

3 结论与讨论

根据栽培试验结果，按照颜色将54个菌株分为深色系列和浅色系列。按照颜色的聚类，在2个系列之间做拮抗分析，结果表明，根据拮抗现象的有无，初步将54个株菌株聚成32个类群。进一步通过ITS序列分析发现，54个供试菌的ITS序列长度为280 bp，与GenBank数据库中的ITS 序列比对发现，其是5.8S rDNA区序列，与平菇菌种的相似度为99%以上。进化树分析表明，54个平菇样品可以聚为2个大类，2个大类遗传关系相对较远、独立进化，可将收集到的54株菌种定为36个差异菌株，但真菌ITS区域变异较快，可提供比较丰富的变异位点和信息位点，因此可作为一种分子标记用于探讨真菌种内变异和属内种间分子系统关系，可作为拮抗法鉴定差异不明显菌株间的补充鉴定方法，拮抗试验可以作为ITS序列菌种鉴定的前期辅助手段。

平菇是重要的食用菌栽培种之一，由于其种类多、个体多态性明显，易受培养条件和其他因素的影响，仅根据形态学进行分类并不能建立稳定的分类系统，给其分类鉴定带来一定的难度[8]，拮抗试验是菌株体细胞之间不亲和的表现，在辅助鉴定分析亲缘关系中得到普遍应用，如秀珍菇[9]、杏鲍菇[10]、真姬菇[11]、香菇[12]等菌种的鉴定及亲缘关系分析，但该方法也存在一定的局限性，因为亲和菌株可能完全相同就是一个菌株，也可能存在遗传差异。ITS1为核基因组序列，由于该序列属于非编码的间隔区，没有自然选择的压力，使得该序列成为较好的分子系统学分析片段。

本研究通过拮抗试验对54个平菇菌株进行了初步鉴定，结果表明，共设计拮抗组合1 431组，拮抗现象不明显的有47组，有1 384个配对(96.72%)形成拮抗反应，其中Ⅰ—Ⅸ组内的菌株之间拮抗不明显，可以认定为9个不同的菌株，其余23个菌株与之拮抗明显，最终将54个菌株初步鉴定为32个不同菌株。后经ITS序列进一步鉴定表明，ITS序列将54个菌株最终鉴定为36个菌株，除拮抗试验的Ⅵ—Ⅸ组之外，其他组合与拮抗试验分析基本一致，这说明拮抗试验虽然是一种简易的鉴定方法，但受主观因素影响较大，特别是在统计过程中对拮抗强度的弱与无之间的界定不是很准确，另外，拮抗线的有无及程度的强弱还受培养基成分的影响[13]，因此，拮抗反应只能作为鉴定菌种间亲缘关系的一个辅助手段，对于拮抗现象明显的菌株可认定是不同菌株，对于拮抗现象不明显的菌株，可通过ITS法对其进一步鉴定认证。