猪肺炎支原体与宿主相互作用研究进展

宁雅茹，丁红雷

西南大学 动物科技学院 兽医传染病学实验室，重庆 400715

猪支原体肺炎 (Porcine enzootic pneumonia，PEP) 又名猪喘气病、猪气喘病或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp) 感染引起的猪的一种慢性呼吸道传染病。患病猪主要表现为咳嗽、喘气、生长迟缓，病理剖检以肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘出现肉样或虾肉样实变为特征[1]。

猪支原体肺炎广泛存在于世界各地，我国超过99%的猪场存在Mhp感染。对该病的防控主要采取生物安全控制、疫苗免疫和投喂抗菌药物3种措施[2]，但现有的商品化疫苗免疫保护效果较差，停止使用抗菌药物后临床症状又会再次出现，生物安全措施难以奏效。对该病的致病机理了解较少是阻碍切断病原传播途径和研发有效疫苗和药物的瓶颈。现阶段科学家难以建立支原体的基因操作平台、基因组中色氨酸由终止密码子TGA编码等特性，给Mhp致病机制研究增加了极大的困难。虽然存在上述种种难题，支原体学家仍然在Mhp与宿主细胞互作方面取得了一定进展。本文结合笔者实验室相关工作，对Mhp致病机制研究进行了综述，并对今后Mhp致病机理研究方向进行了展望，以期为后续的Mhp-宿主互作研究提供借鉴，为有效疫苗和药物开发提供理论依据。

1 猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附

黏附是病原菌与宿主相互作用的第一步。Mhp进入呼吸道后，黏附于气管、支气管和细支气管纤毛上皮细胞，从而完成在呼吸道的定殖，进一步导致纤毛脱落、上皮细胞死亡[3]。参与黏附的主要是膜蛋白，目前已经鉴定的Mhp膜蛋白超过60个[4-6]。其中，如Mhp107、Mhp108 (P116)、Mhp182 (P102)、Mhp183 (P97)、Mhp271、Mhp384、Mhp390 (P68)、Mhp493 (P216)、Mhp494 (P159)、Mhp540 (EF-Tu)、Mhp683、Mhp684 (P146) 等参与了Mhp对宿主细胞的黏附。各黏附蛋白及其已经鉴定的黏附细胞及细胞外基质蛋白见表1。

1.1 P97蛋白家族蛋白

P97蛋白家族蛋白是最早发现的与黏附相关的Mhp蛋白。该家族共包括7个蛋白，分别为Mhp107、Mhp183、Mhp271、Mhp280、Mhp385、Mhp483、Mhp684[7]。最早发现Mhp183蛋白一个分子量为97 kDa的片段与黏附相关，后来发现其家族的大部分成员也参与Mhp对宿主细胞的黏附。

1.1.1 P97

P97蛋白是最早发现的Mhp黏附素，它于1995年在Zhang等鉴定一株单抗F2G5时被发现[8]。F2G5能识别一个97 kDa的Mhp蛋白，该蛋白根据其分子量被命名为P97。当P97蛋白与纤毛结合后，抑制了Mhp与纤毛的结合；但这种抑制不是100%，所以他们认为应该还有其他的黏附素在Mhp与纤毛的结合中发挥作用[8]。Hus等[9]克隆了P97蛋白的核苷酸序列，发现P97蛋白由一个124.9 kDa的蛋白在其第195位氨基酸切割下来后形成。在大肠杆菌中表达的重组P97蛋白也能与猪的呼吸道纤毛结合，且被肝素 (Heparin)和褐藻多糖 (Fucoidan) 阻断；结合部位位于P97蛋白羧基端，该区域有两个重复区，分别命名为R1区和R2区。该研究小组进一步发现纤毛结合部位位于R1区，该区域包含“AAKPV(E)”重复序列；R1区至少要有7个“AAKPV(E)”重复才能完成与纤毛的结合[10]。单独的R1区也能与纤毛结合，但需要包含8个“AAKPV(E)”重复[11]。这说明R1区的“AAKPV(E)”重复及其数量对P97与纤毛的结合至关重要。在不同的菌株中P97蛋白的分子量不同，在J菌株中，其分子量为94 kDa。原蛋白前体的前195个氨基酸则形成一个22 kDa的蛋白；P97的氨基端和羧基端可被进一步切割成66 kDa和28 kDa的两个蛋白[12]。后来发现P97和22 kDa的蛋白是由mhp183基因编码的一个126 kDa的前体蛋白裂解而成[7,13]。

病原菌与宿主细胞外基质 (Extracellular matrix，ECM) 成分的结合在启动致病过程时具有重要作用。这些ECM包括纤连蛋白 (Fibronectin)、玻连蛋白 (Vitronectin)、层黏连蛋白 (Laminin) 和胶原蛋白 (Collagen) 等。ECM蛋白是葡萄糖胺聚糖 (Exogenous glycosaminoglycan)，如肝素、硫酸乙酰肝素 (Heparan sulfate) 和硫酸软骨素B(Chondroitin sulfate B) 的连接蛋白。一些病原菌也能够通过招募外源性葡萄糖胺聚糖到其表面，以方便病原与宿主ECM成分的相互作用。Jenkins等[13]研究发现，P97蛋白的N端 (653个氨基酸)和C端 (301个氨基酸) 都能与肝素以剂量依赖性的方式连接，且R1区和R2区在C端与肝素的连接中都是必不可少的。进一步研究发现P97蛋白除了能与肝素连接，还能与纤连蛋白和纤溶酶原 (Plasminogen) 连接；其羧基端裂解形成的28 kDa蛋白也能单独直接与这3个蛋白结合[14]。

1.1.2 Mhp107

Mhp107蛋白是一个含1 032个氨基酸的104 kDa的P97蛋白家族成员。可以分为大小为42.7 kDa、42.1 kDa和44.8 kDa的N端片段(F1Mhp107)、中间片段 (F2Mhp107) 和C端片段(F3Mhp107)。这3个片段都能和猪呼吸道上的纤毛结合。F1Mhp107片段还能和肝素及纤溶酶原结合；F3Mhp107片段除了能与纤连蛋白结合，还负责与猪肾传代细胞系PK15的黏附[15]。

1.1.3 Mhp271

Mhp271是另一个含重复序列的P97家族蛋白，在其羧基端有3个重复序列，分别为R1A271、R1B271和R2271。该蛋白在不同菌株间序列同源性超过99%，主要变化在其重复序列，特别是R1B271和R2271区域。在R1A271区只有很少的序列变化，R1B271区的重复序列数从3–8个不等。以232菌株基因组为模板克隆的R2271–R1B271片段含9个R1重复和5个R2重复，能够结合肝素、纤连蛋白和猪呼吸道纤毛，R1A271由于重复序列太少不能与这些成分结合[16]。

1.1.4 Mhp385

Mhp385有988个氨基酸，分子量为115 kDa。在其“761L-N-V↓A-V-S766”位点可被半胰肽(Semitryptic peptide) 切割成大小为88 kDa (P88385)和27 kDa (P27385) 的两个蛋白。P88385能被肝素和纤毛结合位点识别，与之结合；P27385虽然有4个R1重复，但不能与肝素和纤毛结合[17]。

1.1.5 P216

Mhp493蛋白分子量为216 kDa，因此也称P216蛋白，它可以分解为120 kDa (P120，N端)和85 kDa (P85，C端) 的两个蛋白，切割位点为“1072T−N-F↓Q-E1076”[18]，这两个蛋白均能和肝素与猪呼吸道纤毛结合[19]。在大肠杆菌表达的P216的3个片段F1P216(35–491位氨基酸)、F2P216(464–908位氨基酸)、F3P216(903–1 444位氨基酸)能够与PK15细胞结合，而F2P216和F3P216则能和纤毛结合[19]。

1.1.6 P146

Mhp683蛋白分子量为147 kDa，因此也称P146蛋白。该蛋白在两个“S/T-X-F↓X-D/E”样位点被切割为3个片段，分别是50 kDa、40 kDa和85 kDa的P50P146(N端片段)、P40P146(中间片段)和P85P146(C端片段)，这3个蛋白均位于Mhp表面，特异性地与猪呼吸道纤毛和肝素结合；此外，P85蛋白还能与纤溶酶原结合[20]。

1.2 P102蛋白家族蛋白

P102蛋白家族也包括7个成员，分别为Mhp108、Mhp182、Mhp272、Mhp274、Mhp275、Mhp384、Mhp683，已经证明Mhp182、Mhp108、Mhp384、Mhp683参与了黏附过程，且Mhp182和Mhp108与黏附密切相关。

1.2.1 P102

Mhp182蛋白是一个含904个氨基酸的102 kDa的蛋白，因此也称P102。该蛋白基因与mhp183位于同一个操纵子，在mhp183基因下游[7]。P102可自身水解为60 kDa和42 kDa的两个蛋白，称为P60和P42。这3个蛋白均位于细菌表面，且能与纤溶酶原结合。P102可使纤溶酶原被组织特异性的纤溶酶原激活剂 (Tissue-specific plasminogen activator，tPA) 激活，使其获得降解纤维蛋白原(Fibrinogen) 的能力。此外，P102和P42还能与纤连蛋白结合；P102具有黏附于PK15细胞的能力[21]。

1.2.2 P116

P116蛋白由mhp108基因编码。该蛋白羧基端的含311个氨基酸的39.6 kDa片段 (F4P116) 在与Mhp表面分子结合过程中发挥重要作用，可与纤连蛋白、纤溶酶原以剂量依赖性方式结合，其羧基端的赖氨酸残基在与纤溶酶原结合过程中发挥重要作用。其37–295位的33.5 kDa (F1P116) 和542–699位的21.8 kDa (F3P116) 片段能与PK15细胞结合；所有4个片段 (F2P116：296–541位氨基酸，32.5 kDa；F4P116：700–1 010位氨基酸，39.6 kDa)均能与猪呼吸道纤毛结合，但与其他3个片段相比，F3P116的结合能力稍弱[22]。因此，P116通过多种途径与宿主细胞黏附。

1.2.3 Mhp384

Mhp384含957个氨基酸，理论分子量为109.2 kDa。在Mhp内找不到完整的Mhp384蛋白，其在“S/T-X-F↓X-D/E”样位点被切割成大小为60 kDa (P60384) 和50 kDa (P50384) 的两个蛋白。P60384和P50384均能被肝素和纤毛结合位点识别并结合[17]。

1.2.4 Mhp683

Mhp683蛋白大小为135 kDa，可自身水解为P45683(N端片段)、P48683(中间片段) 和P50683(C端片段) 3个蛋白，均位于Mhp表面。这3个蛋白之间的切割位点为“TTKF↓QE”。将Mhp683分段表达，分为F1683(42–308位氨基酸，37.3 kDa)、F2683(306–597位氨基酸，41.1 kDa)、F3683(595–803位氨基酸，30.5 kDa)、F4683(801–1 017位氨基酸，31.2 kDa)、F5683(1 017–1 194位氨基酸，27.3 kDa) 5段，这5个片段均能与肝素和猪呼吸道纤毛结合，说明Mhp683的3个自身水解片段也能与肝素和猪呼吸道纤毛结合[23]。

1.3 其他黏附蛋白

1.3.1 Fba

在232菌株中，果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose-1,6-bisphosphate aldolase，Fba) 由mhp014基因编码；在168菌株中，其编码基因为MHP168_014。该蛋白位于Mhp表面，能黏附于猪气管上皮细胞 (Swine tracheal epithelial cells，STEC)。Fba重组蛋白制备的抗体可特异性阻断Mhp对STEC的黏附；经表面等离子共振研究发现其也能与纤连蛋白结合[24]。

1.3.2 Mhp036

Berry等发现，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 也能位于Mhp表面，该蛋白由232菌株的mhp036基因编码。亲和层析结合试验结果表明，Mhp的GAPDH蛋白能与肌动蛋白、纤连蛋白、肝素和纤溶酶原结合[25]。

1.3.3 Eno

Mhp烯醇化酶 (Enolase，Eno) 由232菌株mhp129基因编码，在168菌株和J菌株中分别由MHP168_271和MHJ_0242编码。类似于Fba，Eno也是一种菌体表面蛋白，可以黏附在STEC上，Eno抗体可特异性阻断Mhp对STEC的黏附。免疫印迹和表面等离子共振证明，Eno还能与纤溶酶原以剂量依赖性方式结合[26]。

1.3.4 MHJ_0125

MHJ_0125蛋白由J菌株的MHJ_0125基因编码，在232菌株中对应Mhp252蛋白，分子量为440 kDa，是一种氨肽酶，能形成十二聚体聚合物结构。MHJ_0125也是一个菌体表面的多功能黏附素，能与肝素和纤溶酶原结合。其与纤溶酶原的结合是剂量依赖性的，结合之后能促进tPA对纤溶酶原的激活[27]。

1.3.5 P68

P68蛋白在232菌株和168菌株中分别由mhp390和MHP168_418编码。Liu等研究发现，P68位于Mhp菌体表面，以剂量依赖性方式与猪气管纤毛结合，最佳结合浓度为0.1 μg/L[28]。

1.3.6 MHJ_461

MHJ_461是一种亮氨酸氨基肽酶，在232菌株和J菌株中分别由mhp462和MHJ_462编码，单体分子量为51.4 kDa。在菌体表面形成由超过10个单体聚集而成的分子量分别为500 kDa和800 kDa的多聚蛋白。MHJ_461能与肝素结合，也能结合纤溶酶原，且在tPA存在时，帮助纤溶酶原转化为纤维蛋白酶[29]。

1.3.7 P110

P110是一种糖蛋白，能与猪气管上皮细胞结合。P110能水解为1个P54蛋白和2个P28蛋白，这两个蛋白也分别能与STEC结合[30]。后续研究发现，P110蛋白由159 kDa的Mhp494蛋白 (也称为P159蛋白) 水解而来，该蛋白也能与肝素结合[31]。

1.3.8 P159

P159蛋白能被内源性蛋白酶分别在“233F↓Q234”和“981F↓Q982”位点切割，形成P27、P110和P52三个蛋白[32]。这3个蛋白均能与PK15细胞结合[31-32]，也能与肝素以剂量依赖性方式结合[31-32]；P159的分段重组蛋白F2P159(31–264位氨基酸)和F4P159(958–1 405位氨基酸)能与纤毛结合，这2个区段分别包含在P110和P52蛋白中[32]。

1.3.9 EF-Tu

热不稳定延伸因子 (Elongation factor thermo unstable，EF-Tu) 在232菌株、168菌株和J菌株分别由mhp540、MHP168_533和MHJ_0524基因编码，位于Mhp表面。研究发现该蛋白在Mhp中也可以作为一种黏附因子与细胞表面的纤连蛋白、肌动蛋白和纤溶酶原结合[33-34]，用EF-Tu抗体阻断EF-Tu的功能后，Mhp与STEC的结合能力减弱[34]。

虽然已经发现了近20种黏附相关蛋白，且估计将来还会有新的黏附蛋白被发现，但哪个黏附蛋白及宿主细胞表面的哪种ECM在Mhp对宿主细胞的黏附中发挥主要作用？此外，哪个黏附蛋白可作为下一代Mhp疫苗的保护性抗原？这是今后黏附蛋白研究中需重点解决的问题。

2 猪肺炎支原体对宿主细胞的损伤

不同毒力的Mhp菌株对宿主细胞的损伤程度不一。强毒菌株和中等毒力菌株感染STEC，能造成纤毛变粗、破损和脱落，而弱毒菌株对纤毛影响较小；与弱毒菌株相比，强毒菌株和中等毒力菌株感染细胞后能显著降低细胞活性，促进STEC分泌MUC5B黏蛋白、一氧化氮 (Nitric oxide，NO) 和内源性活性氧 (Reactive oxygen species，ROS)，引起细胞的氧化应激反应，且STEC的损伤程度与菌株的毒力呈正相关[35]。

细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定，由基因控制的有序性的细胞死亡过程。细胞凋亡可被细胞内NO、ROS、促炎细胞因子、激素等激活[36-37]。在许多动物细胞中，过量的NO、ROS和Caspase-3是细胞凋亡的关键介质。过量的NO与超氧阴离子自由基反应形成过氧亚硝酸盐；线粒体产生的过量的ROS能突破细胞抗氧化防御系统发生氧化应激，激活细胞凋亡级联反应；Caspase-3是膜受体调节和线粒体调节的凋亡通路中Caspase级联反应的下游效应因子。脂相关膜蛋白 (Lipidassociated membrane proteins，LAMP) 是Mhp的重要致病因子，它能引起猪肺泡巨噬细胞 (Porcine alveolar macrophage，PAM)系3D4/21的凋亡，这种凋亡是通过产生NO、超氧阴离子和激活Caspase-3实现的[38]。LAMP也能通过p38 MAPK和Bax/Bcl-2信号通路造成猪外周血淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)[39]和St.Jude猪肺上皮细胞系 (St.Jude porcine lung epithelial cell line，SJPL)[40]的凋亡。已经鉴定出多个与凋亡相关的LAMP蛋白，这些蛋白可以作为毒力因子促进细胞凋亡的发生。Mhp的Fba蛋白能刺激STEC产生丙酮酸，导致细胞凋亡[41]。Ⅰ型信号肽酶 (TypeⅠ signal peptidase，SPaseⅠ)则通过Caspase-3级联信号途径促进Mhp诱导的细胞凋亡[42]。Mhp390蛋白除了与猪气管纤毛结合，还能刺激PBMCs中单核细胞和淋巴细胞及PAMs凋亡[28]，从而降低宿主的免疫反应。最近，Mhp597蛋白也被证明能导致PK15细胞凋亡[43]。

除了LAMP蛋白，胆固醇在Mhp导致的宿主细胞凋亡和损伤中也发挥重要作用。胆固醇含量高的猪肺组织，Mhp的感染也更加严重。其原因是胆固醇能加快Mhp的生长，并促进Mhp对PAMs的黏附，进而促进了Mhp导致的细胞凋亡[44]，这种凋亡也是通过增加过氧化氢 (Hydrogen peroxide，H2O2) 和产生NO，上调肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α) 表达水平和激活Caspase-3级联信号途径实现的。

Mhp在代谢过程中产生的代谢产物有时也能成为Mhp的重要致病因子。H2O2属于ROS的一种，易穿透细胞膜，与细胞内的还原型铁离子通过芬顿反应生成高毒性的羟自由基，对多种细胞造成毒性。高毒力Mhp菌株能利用甘油生成H2O2，从而造成对细胞的毒性[45]。开始认为该过程是甘油-3-磷酸氧化酶 (Glycerol-3-phosphate oxidase，GlpO) 将甘油-3-磷酸 (Glycerol-3-phosphate) 转化为磷酸二氢丙酮 (Dihydroxyacetone-phosphate，DHAP)，DHAP产生有细胞毒性的H2O2[46]；后来发现不同毒力菌株之间glpO基因转录水平没有差异[45]。因此，在Mhp中，甘油通过何种途径最终生成H2O2还需进一步研究。

除了对宿主细胞的直接损伤，Mhp的两个表面蛋白酶，Xaa促氨肽酶PepP (232菌株中由mhp680基因编码，J菌株中由MHJ_0659基因编码) 和寡内肽酶F-PepF (232菌株中由mhp520基因编码，J菌株中由MHJ_0522基因编码) 能降解促炎肽，其中PepP能降解缓激肽 (Bradykinin，BK)、P物质 (Substance P)和神经肽Y (Neuropeptide Y，NPY)，PepF能降解BK、P物质和神经激肽(Neurokinin A，NKA)。BK能促进支气管收缩，是一种促炎肽；NPY是一种炎症介质，P物质和NKA有抗菌肽功能，能促进气管支气管内黏液分泌和增加纤毛摆动频率。破坏这4种蛋白就降低了纤毛摆动频率和黏液纤毛清除效率，降低呼吸道纤毛对Mhp的清除，从而有利于Mhp在呼吸道纤毛的定殖[47]。

3 猪肺炎支原体刺激机体导致的炎症反应

Mhp感染猪只后，能刺激机体的PBMCs产生一系列炎症因子，如白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-8、IL-18和TNF-α，这些炎症因子也存在于支气管肺泡灌洗液(Broncho-alveolar lavage fluids，BALF)[48]。Mhp刺激猪的骨髓来源树突状细胞 (Bone-marrowderived dendritic cells，BM-DCs) 产生IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNF-α[49]。此外，Mhp能刺激鼠PAMs细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α；NF-κB在调控这些细胞因子的产生中具有重要作用[50]。Mhp刺激机体产生高水平炎症因子可能是Mhp造成肺部病理损伤的重要原因。进一步研究发现，Mhp390蛋白在Mhp刺激机体产生IL-1β和TNF-α中具有重要作用[28]。此外，Mhp597在Mhp感染细胞导致的炎症反应中也能上调炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α基因的表达。Toll样受体4 (Toll-like receptor 4，TLR4) 在Mhp597诱导的炎症反应中发挥重要作用，将TLR4沉默，能显著降低Mhp597诱导的上述炎症因子的表达；该反应通过TLR4下游的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路实现[43]。

4 宿主的免疫反应

Mhp感染机体引起的免疫反应包括体液免疫、黏膜免疫、细胞免疫和天然免疫。Mhp感染机体后通常要8–24周才能检测到血清IgG抗体[51-52]，也有研究报道Mhp感染后21 d有不超过10%的猪只能检测到血清IgG[53]；全菌抗原制备的灭活疫苗免疫后6周[54]甚至到14周[55]才能检测到IgG，这与经典免疫学理论中病原感染或疫苗免疫后1周左右即可检测到IgG相比大大延迟。其主要原因应是血清抗体产生时间较晚；通过改变ELISA试剂盒的包被抗原，也可能会使IgG的检测时间点提前。Garcia-Morante等[53]研究发现，在Mhp感染后21 d，超过90%的猪只在肺部均能产生IgG，说明IgG在呼吸系统产生较早。此外，IgG水平，特别是IgG2水平与肺部病理损伤呈正相关，抗体水平高则肺部病变严重[53]，这说明血清抗体不能提供免疫保护。Mhp灭活疫苗主要刺激机体产生体液免疫，但灭活疫苗既不能阻止Mhp在呼吸道的定殖，也不能阻断Mhp在猪群内和猪群之间传播，有试验证实已免疫Mhp灭活疫苗的猪群和未免疫猪群之间Mhp的感染率无显著性差异[56-59]，这些研究进一步说明血清抗体在免疫保护中几乎没有作用。

吃初乳仔猪的断奶体重显著高于不吃初乳仔猪的断奶体重，且与初乳摄入量呈正相关[60]。那Mhp初乳抗体是否能发挥免疫保护作用，降低或避免Mhp对仔猪的感染？通过文献分析发现，在Mhp流行严重的猪群中，获得Mhp母源抗体 (主要为IgM)的仔猪不出现猪支原体肺炎临床症状，当母源抗体消失后，断奶仔猪的临床症状就会出现[61]。虽然免疫Mhp灭活疫苗不能阻止Mhp在母猪呼吸道的定殖，但其哺乳仔猪呼吸道中Mhp的定殖率远远低于未经Mhp疫苗免疫母猪所产仔猪哺乳期内呼吸道中Mhp的定殖率，且哺乳仔猪Mhp的感染率和母源抗体水平呈负相关[55,63]。这表明Mhp灭活疫苗产生的母源抗体在对仔猪的免疫保护中发挥了作用。因此，初乳抗体在免疫保护中的作用应是今后Mhp抗感染免疫的一个重要研究方向。

Mhp感染后刺激机体产生的IgA存在于外周血血清、支气管肺泡灌洗液、鼻黏膜、气管、肺门淋巴结和肺部[63]。黏膜抗体IgA产生时间要远远早于IgG的产生时间，以P97蛋白为抗原制备ELISA试剂盒，在Mhp感染后4 d即可检测到鼻腔分泌物中的IgA[64]。因此，可以把IgA作为Mhp感染的早期检测抗体。SIgA可能在Mhp感染中发挥免疫保护功能，当SIgA水平升高后，Mhp导致的临床症状减轻，肺部病理损伤程度和气管纤毛损伤程度降低，Mhp的负载量显著下降[65]。Mhp弱毒疫苗经鼻腔和胸腔免疫能产生高水平SIgA[66]，经气雾免疫也能产生相同的效果[67]。因此弱毒疫苗的免疫效果可能优于灭活疫苗。IgA的产生受TLR2和TLR4的调控，Mhp感染后，TLR2和TLR4的表达量升高；抑制TLR2和TLR4的表达，IgA的分泌明显降低[63]。因此，增强IgA的分泌应是下一代Mhp疫苗研发应考虑的问题。

早期研究认为，细胞免疫在Mhp的免疫保护中可能发挥主要作用[68]，但通过对Mhp感染后猪血清及肺泡灌洗液中IgG1和IgG2的检测，Garcia-Morante等认为Th1细胞调节的免疫反应在Mhp感染中占主导地位，且Th1细胞产生IgG2的水平与肺部病理损伤严重程度呈正相关[53]。由于缺少合适的动物模型及相应的商品化试剂，关于细胞免疫在Mhp感染中的作用研究较少。考虑到现在普遍使用的灭活疫苗免疫效果不佳且其主要刺激机体产生体液免疫，因此，应尽快建立合适的Mhp感染动物模型，加快相应试剂开发，加强对细胞免疫的研究，并评价其在免疫保护中的地位。

Trueeb等报道，Mhp能诱导不同类型的细胞产生天然免疫反应，如能刺激PMBCs和传统树突状细胞2 (Conventional dendritic cells 2，cDC2)产生TNF，也能诱导猪血液中单核细胞、cDC1、cDC2和浆细胞样树突状细胞 (Plasmacytoid dendritic cells，pDC) 上调CD40、CD25的表达，刺激了B细胞的增殖和IgM的产生[69]。自噬(Autophagy) 也是一种天然免疫反应，是细胞质中非特异性蛋白质被具有双层膜结构的自噬体(Autophagosome) 包裹，与溶酶体融合形成自噬溶酶体 (Autolososome)，最终将自噬溶酶体中包裹的物质降解的过程。近年来有研究发现，Mhp能进入猪的传代细胞系，如Che[70]和Raymond[71]等分别在2014年和2018年报道Mhp能进入PK15细胞；另一项研究证明Mhp也能进入猪肺泡巨噬细胞[72]。笔者实验室从采集的猪肺泡巨噬细胞中检测到了Mhp，进一步说明Mhp能进入细胞内。我们还发现Mhp感染猪肺组织的临床样本中，与Mhp阴性样品相比，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达量明显升高，且与Mhp形成共定位；Mhp感染PK-15细胞能显著增加自噬标志蛋白的表达，说明Mhp感染PK-15细胞也能导致自噬发生。此外还发现自噬体与溶酶体不能融合形成完整的自噬流，这造成Mhp在细胞内随着感染时间延长大量增殖，表明自噬促进了Mhp在细胞内的增殖，但这种自噬反应是通过哪条信号通路介导还需进一步明确。自噬体与溶酶体的融合需要可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子黏附蛋白受体 (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors，SNARE) 复合物 (包括syntaxin 17、SNAP29、VAMP8等蛋白) 和Rab7、LAMP2的参与，SNAP47、ATG14也参与了这一融合过程。Mhp如何与这些蛋白相互作用阻断自噬体与溶酶体的融合是本实验室下一步要开展的工作。

5 总结与展望

Mhp感染宿主细胞的首要步骤是对宿主细胞的黏附，已经有十几个与黏附相关蛋白被鉴定出来，其黏附机制大部分也已经被阐明。Mhp黏附之后对宿主细胞的直接损伤包括对纤毛的破坏、细胞毒性作用、宿主细胞的凋亡与死亡等，这些直接损伤是由哪些毒力因子导致的，如何实现与宿主细胞的互作及互作机制是什么，仍需进一步阐明。由于难以对Mhp开展基因操作，这给毒力基因的鉴定及其功能研究造成了很大的困难。建立Mhp基因操作系统应是今后Mhp致病机制研究需要攻克的重要技术平台。

由于尚未建立Mhp感染的动物模型，使得Mhp相关的免疫学研究较为滞后，特别是其引起的初乳体液免疫、细胞免疫及天然免疫研究；另一方面就是Mhp如何逃避免疫系统攻击，实现其在宿主细胞内的增殖。此外，哪些蛋白，特别是哪些膜蛋白和分泌蛋白在免疫保护中扮演重要角色需要明确。笔者实验室已经鉴定了36个血清体液免疫显性蛋白和8个只在体内表达而体外无细胞培养不表达的血清体液免疫显性蛋白[73](部分研究结果相关论文尚在审稿中)，这些蛋白的免疫学功能及免疫保护作用仍需要细胞学和动物试验来证明。

加强Mhp与宿主互作及免疫机制研究将是今后Mhp基础研究的重要方向，这有助于Mhp致病机制的阐明，同时对预防性生物制品和小分子靶向抗菌药物的开发具有重要的理论指导意义。