三七根际土壤中皂苷类自毒物质降解拮抗细菌的分离筛选

王罗涛 杨冬英 邓琳梅 李怡文 马云云 韩光煜 黄惠川 朱书生 杨敏

摘要：【目的】筛选出既可降解三七皂苷类自毒物质又能拮抗三七锈腐病菌的细菌菌株，为防治三七病害及克服连作障碍提供生防资源。【方法】利用连续稀释法从健康三七根际土壤中分离可培养细菌，测定细菌菌株在以粗皂苷为唯一碳源培养基上的生长情况，以对峙培养法测定细菌菌株对三七锈腐病菌毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006的拮抗活性;结合16S rDNA测序和形态学特征对活性菌株进行分类鉴定，并通过HPLC测定活性菌株在不同时间内对主要皂苷类自毒物质（R1、Rg1、Re、Rb1和Rd）的降解能力。【结果】从三七根际土壤中分离获得91株细菌分离物，其中17株分离物能在以粗皂苷为唯一碳源的培养基上生长、14株分离物对菌株RS006具有拮抗活性;菌株41既能以三七粗皂为唯一碳源生长，又对菌株RS006具有较强抑制活性。综合菌株41的形态特征和16S rDNA分子鉴定结果，将菌株41鉴定为蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii），编号为PM-41。菌株PM-41对三七主要皂苷类自毒物质R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均存在较明显的降解效果。【结论】蒙氏假单胞菌PM-41既能拮抗毁灭柱孢菌又能有效降解三七皂苷类自毒物质，具有防治三七锈腐病和缓解三七连作障碍的生防潜力。

关键词： 三七;连作障碍;自毒作用;锈腐病菌;微生物降解

中图分类号： S435.672                              文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）02-0305-08

Isolation and screening of antagonistic autotoxin-degrading bacteria in Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen rhizosphere soil

WANG Luo-tao， YANG Dong-ying， DENG Lin-mei， LI Yi-wen， MA Yun-yun，

HAN Guang-yu， HUANG Hui-chuan， ZHU Shu-sheng， YANG Min*

（Key Laboratory of Agriculture Biodiversity for Plant Disease Management of Ministry of Education， Yunnan Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan， Kunming  650201， China）

Abstract：【Objective】Isolation and screening of antagonistic saponin-degrading and rust rot resistant bacteria in the rhizosphere soil of Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen were conducted， laying foundation for developing new technology to control P. notoginseng diseases and alleviate P. notoginseng replant failure. 【Method】The bacterial strains were isolated from healthy P. notoginseng rhizosphere soil by the serial dilution method， the ability of bacterial isolates to use crude saponins as sole carbon source was tested， and their inhibition activity against Cylindrocarpon destructans RS006 was also determined by confrontation culture. The antagonistic isolate were further identified by 16s rDNA sequencing and morphology characters，the ability to degrade the main five autotoxic saponins（R1，Rg1，Re，Rb1 and Rd） after inocula-ting at different time points were evaluated using HPLC. 【Result】A total of 91 bacterial strains were isolated from P. notoginseng rhizosphere soil， among them 17 isolates were able to grow on the medium with crude saponin as the sole carbon source， and 14 isolates showed strong antifungal activity against strain RS006. Strain 41 could grow with crude saponins as sole carbon source， and had strong antifungal activity against strain RS006. According to the morphological chara-cteristics and 16S rDNA molecular identification results， the antagonistic strain No.41 was identified as Pseudomonas monteilii（PM-41）. Strain PM-41 had obvious degradation on the five autotoxic saponins（R1，Rg1，Re，Rb1 and Rd）. 【Conclusion】P. monteilii PM-41 has antagonistic activity on C. destructans and efficient degradation ability on autotoxic saponins. It has the potential prospect in controlling P. notoginseng root rot and alleviating P. notoginseng replant failure.

Key words： Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen; replant failure; autotoxicity; Cylindrocarpon destructans; microbial degradation

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31772404，31660605）; National Key Research and Development Program（2017YFD0201601）; Yunnan Universities and Colleges Innovation Team Support Plan（IRTSTYN）

0 引言

【研究意义】三七[Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen]为五加科人参属多年生药用植物，是我国的名贵中药材，主要分布于云南省文山州和广西百色地区（缪作清等，2006）。三七生长性喜温暖阴湿，栽培年限长，种植过程中存在严重的连作障碍。Yang等（2015）研究表明，三七根系分泌的皂苷类化合物是造成三七连作障碍的重要诱因。目前，生产中主要通过施用化学农药、轮作倒茬等措施缓解三七连作障碍，但农药的大量使用不但未能明显减轻连作障碍，而且带来严重的农药残留和重金属超标等药品安全问题;同时，三七轮作期限一般需要10年以上（郭宏波等，2017）。因此，以绿色健康的防治手段缓解三七连作障碍对三七产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】化感自毒是造成作物连作障碍的主要原因之一（Singh et al.， 1999）。游佩进（2009）通过比较三七土壤水提液和根部化合物，利用HPLC-MS分离鉴定出相同化合物人参皂苷Rh1，发现Rh1在较低浓度下对三七幼苗生长表现显著的抑制效果;张金燕等（2017）研究发现三七土壤水提液对三七种子的萌发和幼苗生长有抑制作用。另有研究发现，三七皂苷类化合物人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1对三七幼苗萌发和生长产生不同程度的抑制（拱健婷等，2015）;一方面三七根系分泌的皂苷类自毒物质（皂苷R1、Rg1、Re、Rg2和Rd）对三七根部细胞产生明显的损害（Yang et al.， 2015，2018），另一方面，三七皂苷提取物能明显促进三七根腐病菌茄腐镰刀菌、锈腐病菌和恶疫霉菌的生长（杨敏等，2014）。根际微生物与植物生长有着密切的关系。微生物作为植物的第二基因组，植物对根际微生物的影响主要是通过根系分泌物来实现（Etalo et al.， 2018）。根系分泌的小分子化合物（糖、氨基酸、有机酸、酚类及其他次生代谢产物）和大分子的蛋白和黏液等既能提供微生物生长所需的养分，又能作为信号来激活或募集微生物（Zhalnina et al.， 2018）。植物能通过募集有益微生物帮助自身抵御外界生物（病原菌的侵染、植食昆虫的取食）和非生物（温度、水分和盐分等）胁迫（Chaparro et al.，2014）。植物根际土壤作为植物的一个有益菌库，一直是国内外研究植物—微生物互作的研究热点。王志春和孙星星（2018）从番茄根际土壤中分离到一株对番茄枯萎病菌具有较强活性的拮抗细菌，通过菌液浇灌的方式验证其对番茄枯萎病和根腐病具有良好的防治效果。导致植物化感自毒的次生代谢产物主要有酚类化合物、萜类化合物和含氮有机物等，采用常规的物理化学方式处理很难获得明显的效果，且容易产生二次污染，因此微生物作为绿色高效的处理方式受到越来越多学者的关注（张晓玲等，2007）。赵东岳等（2013）从人参根际分离到5株具有高效降解人参自毒物质苯甲酸、邻苯二甲酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯、棕榈酸和2，2-（4-羟基苯基）丙烷的细菌。祁国振等（2016）通过分离苹果根际土壤得到5株具有降解苹果自毒物质根皮苷、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸和焦性没食子酸的高效降解细菌，为缓解苹果化感自毒作用提供了新思路。何志刚等（2017）从番茄根部分离到3株降解番茄自毒物质苯甲酸的细菌，并通过菌剂添加方式验证了微生物菌剂缓解自毒物质对番茄幼苗的抑制。【本研究切入点】已有研究表明根际微生物能降解植物分泌的自毒物质，从而缓解植物化感作用。但三七在生长过程中是否会募集有益微生物来降解代谢其分泌到根际的皂苷类自毒物质至今未见相关报道。【拟解决的关键问题】利用连续稀释法从健康三七根际土壤中分离可培养细菌菌株，进而测定细菌菌株在以粗皂苷为唯一碳源培养基的生长情况，并利用对峙培养法测定其对三七锈腐病菌的拮抗活性，在此基础上进一步对活性菌株进行16S rDNA分类鉴定，借助HPLC评价接种活性菌株后不同时间对主要皂苷类自毒物质的降解能力，以期从三七根际土壤中分离到既可降解三七皂苷类自毒物质又能拮抗三七锈腐病菌的细菌菌株，为防治三七病害及克服三七连作障碍提供生防資源。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试培养基：NA培养基（蛋白胨10.00 g、牛肉浸粉3.00 g、氯化钠5.00 g、琼脂粉15.00 g，蒸馏水定容至1000.0 mL）;粗皂苷培养基（硝酸钠3.00 g、磷酸氢二钾1.00 g、七水合硫酸镁0.50 g、氯化钾0.50 g、硫酸亚铁0.01 g、三七粗皂苷10.00 g、琼脂粉15.00 g，蒸馏水定容至1000.0 mL，pH 7.2±0.2）;LB液体培养基（胰蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、氯化钠5.00 g，蒸馏水定容至1000.0 mL）。

供试土壤：取健康三七植株，抖落根围土壤，用无菌毛刷轻刷三七根系收集土壤，即为三七根际土壤。

供试菌株：三七锈腐病菌毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006由云南农业大学农业生物多样性与病害控制实验室从感病三七根部分离获得，并通过形态学鉴定和致病性测定。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 三七根际细菌分离及纯化 采用连续稀释法分离健康三七根际土壤样品中的细菌菌株。称取健康三七根际土样1 g分别置于15 mL的离心管中，加入9.0 mL无菌水，置摇床上振荡（180 r/min）20 min，得到土壤菌悬液，静置后将土壤菌悬液用无菌水梯度稀释成10-2、10-3和10-4，分别取100 ?L均匀涂布在NA培养基表面，置于28 ℃恒温箱中培养2～3 d。待菌落长出后，挑取颜色、形状差异明显的菌落，用无菌牙签在NA培养基上划线，反复划线直至得到细菌单菌落。

1. 2. 2 三七粗皂苷提取 按Yang等（2015）的方法将自然风干的3年生三七块根，用打粉机研磨成粉，取20 g三七粉末分别置于50 mL离心管中，用10.0 mL 80%甲醇超声（30 ℃）提取40 min后离心（4 ℃，12000 r/min，5 min），收集上清液，下层粉末再重复提取2次，离心后合并3次上清液，将所有上清液用旋转蒸发仪蒸发（40 ℃），待甲醇蒸发完后收集剩余液体，冷冻干燥48 h后收集三七粗皂苷固体粉末，4 ℃保存备用。

1. 2. 3 筛选以三七粗皂苷为唯一碳源生长的细菌 将上述分离纯化的细菌，采用平板划线法在以粗皂苷为唯一碳源的培养基上培养。划线后的培养基置于28 ℃恒温箱中培养，2～5 d后观察粗皂苷培养基上菌株的生长情况，每株菌株设4个重复。

1. 2. 4 筛选对三七锈腐病菌有拮抗活性的细菌

采用平板对峙法测定细菌分离物对毁灭柱孢菌RS006的拮抗活性。用直径为5 mm的打孔器在预先培养好的菌株RS006菌落边缘打取菌饼，并放置在PDA培养基中央，在距菌饼2.5 cm的4个点上分别用无菌牙签接种不同细菌分离物，以只接种菌株RS006的培养基为对照，每株菌株设4个重复。接种好的培养基置于25 ℃恒温箱中培养，6～7 d后测量对照组和处理组病原菌菌落半径，计算菌丝抑制率。

抑制率（%）=（对照菌落半径-处理菌落半径）/

对照菌落半径×100

1. 2. 5 菌株鉴定 对筛选获得的既能以皂苷为唯一碳源生长又对菌株RS006具有拮抗活性的细菌菌株进行形态观察和16S rDNA鉴定。参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）对菌株进行菌落、菌体形态观察;分子鉴定采用试剂盒OMEGA Bacterial DNA Kit提取细菌基因组DNA，采用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。扩增体系50.0 μL：27F（10 μmol/L）和1492R（10 μmol/L）各2.0 μL，25.0 μL 2×PCR Taq MasterMix，DNA模板2.0 μL，19.0 μL无菌去离子水。反应程序：95 ℃预变性4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物送昆明硕擎公司测序，测得序列与NCBI数据库进行BLAST比对分析，选取相似度高的种属确定供试细菌分离物的分类地位。在NCBI数据库中下载相近序列，利用MAGA 7.0进行序列系统发育分析，利用Neighbor-joining算法和Jukes-Cantor模型构建系统发育进化树。

1. 2. 6 HPLC分析活性菌株降解三七皂苷类自毒物质的能力 参照赵东岳等（2013）的方法对筛选获得的活性菌株进行降解能力测定。用接种环挑取纯化好的单一菌株，接种到50.0 mL的NA液体培养基中，置于28 ℃、150 r/min的摇床上培养过夜;取100 μL菌液加入到200.0 mL以三七粗皂苷为唯一碳源的液体培养基中（三七粗皂苷1 g/L），以不加入菌液的处理作为空白对照，置于摇床上振荡培养（28 ℃，150 r/min），每处理设3次重复，培养96、144和192 h时分别取样测定。

从每瓶摇培菌液中取100.0 mL液体加入等体积甲醇，摇匀，20 ℃超声20 min，静置5 min后取200.0 mL混合液用0.22 μm的微孔滤膜真空抽滤，将抽滤好的溶液用旋转蒸发仪40 ℃旋转蒸发至甲醇蒸发干;取20.0 mL溶液放入-20 ℃冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中干燥48 h。待溶液干燥后，加入20.0 mL 70%色谱甲醇超声溶解，充分摇匀后取10.0 mL溶液到15 mL离心管中离心（4 ℃，9000 r/min，5 min），取澄清液1.5 mL用0.22 ?m的尼龙滤膜过滤3次，滤液置于4 ℃保存备用。

利用HPLC检测不同处理中主要皂苷物质（R1、Rg1、Re、Rb1和Rd）的含量，并计算接菌处理中主要皂苷類自毒物质的降解率。HPLC检测条件：色谱柱（4.6 mm×150.0 mm，4 ?m，Agilent Poroshell 120 EC-C18）;流动相A：乙腈;流动相B：水;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长203 nm;进样体积10 ?L。洗脱梯度：0～20 min，82% B;20～40 min，82%～57% B;40～48 min，57%～45% B;48～54 min，45% B;54～56 min，45%～5% B;56～71 min，5% B;71～72 min，5%～82% B;72～74 min，82% B。在此条件下，可实现5种主要皂苷达到基线分离。

降解率（%）=（未接菌培养液的皂苷含量-接菌

培养液皂苷含量）/未接菌培养液

的皂苷含量×100

1. 3 统计分析

利用Excel 2013进行数据处理，运用SPSS 19.0中的Duncans新复极差法进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 三七根际土壤细菌分离结果

从NA培养基上挑选颜色或形态特征具有差异的微生物，经划线纯化后获得细菌分离物91株。将91株细菌分离物保存于LB-甘油中（甘油终浓度40%），置于-20 ℃保存备用。

2. 2 三七粗皂苷降解细菌筛选结果

由表1可知，91株细菌分离物中有17株能以三七粗皂苷为唯一碳源生长，分别是菌株1、3、21、41、42、43、50、51、52、53、54、57、58、63、64、70和71，其余74株细菌不能利用三七粗皂苷生长。由此可见，三七根际细菌中大多数细菌不能利用三七皂苷为唯一碳源生长，仅有少数细菌可能具有降解三七皂苷类自毒物质的能力。

2. 3 对三七锈腐病菌具有拮抗活性菌株筛选结果

平板对峙培养试验结果（表2）表明，对菌株RS006具有抑制作用的菌株有14株，其中抑制率大于50.00%的有4株，分别为菌株17、24、36和46;大多数菌株对菌株RS006的抑制率在30.00%～40.00%，包括菌株32、41、42、49、53、65、81和91;菌株18和70的抑制率在20.00%～30.00%。

2. 4 拮抗菌株鉴定结果

由表1和表2可看出，菌株41既能以三七粗皂为唯一碳源生长，又对菌株RS006具有较强的抑制活性，因此进一步对菌株41进行形态观察和16S rDNA分子鉴定。

菌落形态观察结果（图1-A）显示，菌株41在NA培养基上生长48 h后形成白色圆形小菌落，菌落表面光滑隆起，边缘不规则，不透明;由革兰氏染色结果（图1-B）可知，菌株41革兰氏染色呈阴性，菌体呈短杆状，无芽孢。

将菌株41得到的序列输入NCBI数据库进行BLAST比对分析，结果显示，菌株41与蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）相似性最高，为98.35%，GenBank登录号G0V375SV014。利用MEGA7.0构建的系统发育进化树（图2）显示，菌株41与蒙氏假单胞菌CIP 104883（登录号NR 024910.1）位于同一分支，说明二者的亲缘关系最近，且与假单胞菌属的其他种能明显分开。综合菌株41的形态特征和16S rDNA分子鉴定结果，将菌株41鉴定为蒙氏假单胞菌，将其编号为PM-41。

2. 5 HPLC检测蒙氏假单胞菌PM-41对皂苷类自毒物质的降解能力

由表3可知，菌株PM-41对三七粗皂苷中5种主要皂苷类自毒物质R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均具有较强的降解活性，随着接种时间的延长，皂苷R1在4个时期的浓度均存在显著差异（P<0.05，下同）;皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd在接種0 h与接种96 h间差异不显著（P>0.05，下同），但浓度有所降低，而在接种144和192 h后，4种皂苷的浓度显著降低（皂苷Rd在接种144和192 h后浓度低于96 h时的浓度，但差异不显著）。结合降解率分析可知，5种皂苷在接种菌株PM-41 96～144 h出现明显降解，可推断这5种皂苷的主要降解时间为96～144 h。在培养后期（144～192 h），皂苷Rb1和皂苷Rg1的降解率趋于平缓;皂苷Re和皂苷Rd的降解率仍表现持续上升的趋势，可能还存在降解;而皂苷R1浓度出现先降低后升高的趋势，可能与皂苷之间的转化有关（许欢等，2017）。

3 讨论

本研究从健康三七根际土壤中分离到91株细菌，并从中筛选获得一株既能在以三七皂苷为唯一碳源的培养基上生长，又对毁灭柱孢菌具有明显拮抗活性的蒙氏假单胞菌菌株PM-41，HPLC测定结果显示菌株PM-41对5种主要三七自毒皂苷类化合物R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均具有较好的降解效果，为缓解三七连作障碍提供了新思路。

通过微生物降解环境中的有毒物质，已成为当前的研究热点。环境科学中，通过微生物降解土壤中的苯酚、DDT和多环芳烃类化合物已得到广泛应用（贺强礼等，2016;冯玉雪等，2018）。以生物降解的方式进行有害物质降解，一方面可避免物理化学处理过程中可能存在的二次污染问题，另一方面，微生物降解效率比常规方法高，而且更环保（周开胜，2017）。在农业生产方面，已有研究显示，微生物能有效降解植物通过根系分泌到根际土壤中的自毒物质，如苯甲酸、根皮苷、邻苯二甲酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯、棕榈酸和2，2-（4-羟基苯基）丙烷等（黄园勇等，2013;赵东岳等，2013;刘紫英等，2018;聂园军等，2018）。

假单胞菌属（Pseudomonas）作为土壤及植物中广泛存在的生防菌，在帮助植物抗病、促生，联合固氮解钾，降解植株内的农药残留和抵御重金属胁迫等方面均具有显著的效果（张晖等，2015;刘丹丹等，2016;张春花等，2017;代志和高俊明，2018）。袁莲莲等（2017）研究发现，利用蒙氏假单胞菌对受TMV污染的烟草幼苗进行生物钝化，表现出明显的效果;此外，蒙氏假单胞菌对烟草产生的烟碱也有明显降解效果（李阳等，2015）。蒙氏假单胞菌作为五味子中的内生细菌，对人参锈腐菌表现出较强的拮抗效果（徐丽等，2009）。

土壤环境复杂多变，土壤微生物多样性丰富，再加之土壤微生物间复杂的相互作用组成了土壤环境复杂的生态网络。已有研究表明，单一的微生物添加难以在复杂的土壤环境中定殖生存（Xu et al.， 2019）。微生物的相互作用关系复杂多样，且微生物间存在代谢物相互利用的情况（Berendsen et al.， 2018）。因此，尝试以多种微生物组合的形式添加到土壤中（Duran et al.， 2018），形成稳定的微生物菌群，更能有效发挥有益微生物的作用。本研究后续将从菌群构建的角度出发，以分离到的降解细菌为出发点，筛选出更多的高效降解微生物，并通过菌群组合的方式，提高微生物菌群的降解能力，进一步缓解三七的连作障碍。

4 结论

从三七根际土壤分离获得的蒙氏假单孢菌菌株PM-41既能有效降解三七皂苷类自毒物质，对引起三七根腐的毁灭柱孢菌也具有较强抑制活性，具有防治三七锈腐病和缓解三七连作障碍的生防潜力。

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