七叶一枝花种质资源在福建地区的适应性评价

苏海兰，郑梅霞，陈 宏，单寄坪，朱育菁

(1.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003；2.福建承天农林科技发展有限公司，福建 南平 354100)

重楼为我国濒危珍稀中药材，具有镇痛、止血、抗炎和抗肿瘤等活性，是云南白药和片仔癀等260多种中成药的主要原料[1—4]。七叶一枝花(别名华重楼)(Paris polyphyllavar.chinensis)和云南重楼(别名滇重楼)(P.polyphyllavar.yunnanensis)是历版《中国药典》收载的2 种重楼基原药材。近年来，福建、江西和浙江等南方低山丘陵区重楼种植面积不断扩大，但存在药材依赖采挖野生资源、缺乏主栽品种、引种云贵高原重楼种质资源失败等问题，同时，南方低山丘陵区相关重楼资源适应性评价尚未见有报道。黎华君等[5]对野生重楼资源的种类、分布情况及形态特征进行了归纳，对百宜野生重楼资源的保存和利用等提出了建议。尹鸿翔等[6]对川、滇地区重楼属的资源、开发利用情况和濒危状态开展了实地调查，并依据《中国药典》重楼药材的质控标准对该地区50 份重楼药材进行质量评价。苏泽春[7]等采用TOPSIS 法与聚类分析法对23 份云南重楼资源的亲缘关系进行综合评价，其中有12 份云南重楼资源具有优势种源的特性，且在4 个聚类群中均有分布。对南方低山丘陵区重楼资源适应性的研究报道尚少，导致盲目引种和栽培不当等现象时有发生，严重制约重楼种植产业的发展。本文搜集全国各地120 份重楼资源，并统一栽植在福建省光泽县，通过对其物候期、农艺性状和重楼皂苷含量等指标进行测定和分析，对在该地生长较好的七叶一枝花资源进行适应性评价，为筛选优良品种和选择适宜的种质资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重楼资源120 份，其中福建省67 份，云南省16 份、江西省9 份、四川省9 份、湖北5 份、湖南4 份、贵州省3 份、安徽省3 份、广州2 份和河南省2 份(表1)。每份资源10～300 株，于2014 年栽植于福建省光泽县承天重楼基地。海拔266 m，年平均气温17.6 ℃，平均降雨量1876.4 mm。供试土壤为砂质壤土，土壤pH 5.1，有机质29 g·kg-1，全氮0.146%，全磷0.43%，全钾3.67%，土粒密度2.48 g·cm-3。

1.2 方法

1.2.1 资源鉴定

用形态学和分子标记技术鉴定方法对搜集的重楼资源进行鉴定。

1.2.2 物候期观测

对120 份资源根据重楼植株的外部形态变化，记录重楼从出苗至倒苗的时间，包括重楼出苗期、开花期、结果期和倒伏期。各物候期连续观测2 年，若有资源第二年不出苗，则以第一年观测数据为准。

出苗期：记录20%资源出苗的日期，分析时折算成农历初一到出苗所需的天数；

开花期：从出苗期至20%植株开花所需的天数；

结果期：从出苗期至20%植株果实开始膨大所需的天数；

倒伏期：从出苗期至20%植株倒伏所需的天数。

1.2.3 七叶一枝花农艺性状测定和田间病害调查

选取第二年有出苗或长势较好的资源，经鉴定均为七叶一枝花，于7 月进行地上部农艺性状及田间病害观测，11 月挖取相应的植株测量地下部性状，每份资源调查5 株。农艺性状测定包括株高、茎粗、叶长、叶宽、叶片数量、叶柄长、根茎长、根茎直径、根系长、刻痕数、根系鲜重和根茎鲜重。田间病害调查包括茎腐病、叶斑病和灰霉病，对发病情况进行统计并计算发病率。

1.2.4 七叶一枝花皂苷含量测定

根据2015 年版《中国药典》方法，采用HPLC法对其中长势较好的49 份七叶一枝花资源的重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅰ进行测定，并计算四种重楼皂苷的总含量。

1.2.5 数据处理

采用Excel 2007 进行常规分析，采用DPS 18.10软件进行统计分析，获得最小值、最大值、平均值、标准差和变异系数，采用系统聚类法欧氏距离对各资源的特征数据进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 重楼资源鉴定

120 份重楼资源的来源见表1，前期以形态学分类为基础，并利用DNA 条形码技术对搜集的重楼资源进行鉴定，结果发现有七叶一枝花、云南重楼、亮叶重楼(Paris nitida)、球药隔重楼(P.fargesii)、凌云重楼(P.cronquistii)、毛重楼(P.mairei)、狭叶重楼(P.polyphyllavar.stenophylla)和北重楼(P.verticillata)。利用ITS2条形码鉴别及遗传变异位点分析，云南重楼长度范围是457～665 bp，七叶一枝花序列长度范围是457～663 bp；区分云南重楼和七叶一枝花的序列位点共计8 处；七叶一枝花样本之间遗传距离是0～0.004，云南重楼样本之间的遗传距离是0～0.054。ITS2序列的遗传位点和聚类分化与品种有关，资源的地理位置越接近，其相对遗传距离越小，说明不同地域环境是影响重楼遗传序列变化的重要因素。

2.2 不同重楼资源在福建物候期表现

不同重楼资源在福建省光泽县气候条件下出苗、开花、结果及倒苗的物候期性状差异显著，各物候期性状的变异系数分别为93.3%、47.8%、63.2%和18.1%，其中出苗期的变异系数最大；开花期和结果期的变异系数均超过35%；倒苗期的变异系数最小，但也超过15%。重楼资源间的出苗期最大相差3 个多月，广东省资源出苗时间最早(2018 年2月1 日)，云南省资源出苗时间最晚(2018 年5 月13日)，福建本地资源一般于2018 年2 月上中旬出苗。

各资源物候期通过主成分分析(图1)，结合聚类分析结果(表2)，可分成六类。第1 类群有82 个资源，占68.3%，2 月出苗，地上部植株年生长时间平均276 d，主要为福建、江西和广东的重楼资源。第2 类群有31 个资源，占25.8%，4 月底至5 月中旬出苗，第一年地上部植株生长时间平均160 d，主要为云南、四川及贵州的重楼资源，花期与展叶期相近，果实基本上没有膨大，即没有完整的物候期。第3 类群有1 个资源，占0.8%，为湖北的重楼资源，地上部植株年生长时间最短(47 d)。第4 类群有3 个资源，占2.5%，为四川的重楼资源，4 月出苗，地上部植株年生长时间为58 d，病害发生较严重，地上部植株提前倒伏。第5 类群有1 个资源，占0.8%，为湖南的重楼资源，2 月出苗，地上部植株年生长时间仅82 d。第6 类群有2 个资源，占1.6%，为河南的重楼资源，4 月上旬出苗，地上部植株年生长时间平均233 d，有完整物候期。各地重楼资源在福建种植后，原产地海拔越高的资源出苗时间越晚。由于环境因素影响，云南、四川和贵州等地区的重楼资源在福建省种植的第一年有现蕾，但没有果期；种植的第二年没有现蕾，80%没有出苗，20%的出苗期推迟至5 月1 日后，植株地上部8 月枯萎，重楼资源的营养生长和生殖生长状态不良。与福建南平光泽基地同一纬度及地形地貌相似地区的重楼资源具有完整物候期。

表2 不同类型重楼资源物候期Table 2 Growth period indicators of different group of Rhizoma Paridis

主成分分析如表3 所示，4 个主要物候期中，前2 个特征根的累积贡献率达88.480%，说明4 个主要物候期的绝大部分相关信息可由这前2 个主成分来概括。第1 主成分的特征值是2.684，贡献率为67.106%，以出苗期的特征向量值最大，其次是开花期。说明出苗期对第1 主成分的影响最大，其次是开花期，因此将第1 主成分称为物候期因子。增大第1 主成分值，可以使物候期增长。第1 主成分的结果期和倒伏期的特征向量为负值，说明倒伏期越早，物候期越短。第2 主成分的特征向量中，载荷较高的是倒伏期，故出苗期和倒伏期这2 种物候期可作为低山丘陵区域重楼资源的主要物候期。

图1 重楼资源物候期主成分分析图Fig.1 Principal component analysis of phenological periods of Rhizoma Paridis

表3 物候期相关矩阵的特征根、贡献率及累计贡献率Table 3 Characteristic root,contribution rate and cumulative contribution rate of the phenological phase correlation matrix

2.3 七叶一枝花不同种质资源抗病性比较

120 份重楼资源中第二年长势较好的有49 份七叶一枝花资源，对其田间叶斑病、茎腐病和灰霉病的发生情况进行调查。南方低山丘陵区域春夏季节多雨，七叶一枝花地上部植株的主要病害种类有叶斑病、茎腐病和灰霉病。七叶一枝花资源病害的变异系数如表4 所示，灰霉病的变异系数最大(250.1)，叶斑病和茎腐病的变异系数次之，但均超过50%，说明七叶一枝花资源病害变异丰富，可作为良种筛选的有效指标。

主成分分析如表5 所示，3 个主要病害前2 个特征根的累积贡献率达77.038%，说明3 个主要病害的绝大部分相关信息可由这前2 个主成分来概括。第1 主成分的特征根是1.380，方差贡献率为46.011%，以叶斑病的特征向量值最大，其次是灰霉病，两者特征向量值相近，说明叶斑病和灰霉病对第1 主成分的影响大。第2 主成分的特征根是0.931，方差贡献率为31.027%，以茎腐病的特征向量值最大，说明茎腐病对第2 主成分的影响最大。将第1和2 主成分称为抗病性因子，增大第1 主成分值，可以增大七叶一枝花资源的抗病性。

表4 七叶一枝花资源病害发生情况及变异系数Table 4 The disease occurrence and its variation coefficient of Paris polyphylla var. chinensis resources

表5 七叶一枝花资源抗病性主成分分析Table 5 Analysis of principal component on disease resistance of Paris polyphylla var. chinensis resources

2.4 七叶一枝花资源不同农艺性状的相关性

移栽2 年后，80%重楼资源的果实为无效果，故没有测定生殖性状。七叶一枝花资源农艺性状相关性如表6 所示。七叶一枝花资源的茎粗性状比较特别，与株高、叶数、叶宽、叶柄长均为极显著负相关，与根系重、根茎重和叶长亦为负相关，有待持续和大量观测；地上部性状均与根茎鲜重成正相关，根茎直径和根系重量与根茎鲜重呈极显著正相关；刻痕数与农艺性状均为正相关，刻痕数是反映重楼生长年限的一个指标，说明在一定范围内，生长年限越长，各指标值越大。该结果可用于指导生产。种植地土壤疏松和有机质含量高有利于七叶一枝花根系生长，提高产量。

表6 七叶一枝花资源农艺性状相关性Table 6 Correlation of agronomic traits of Paris polyphylla var. chinensis resources

七叶一枝花资源的农艺性状变异系数如表7，不同资源的农艺性状有明显的区域性差别。各个农艺性状的变异系数从大到小依次为根茎鲜重>根鲜重>叶柄长>株高>叶长>茎粗>根系长>叶宽>根茎长>根茎直径>刻痕数>叶片数，根茎鲜重的变异系数最大，叶片数的变异系数最小。

表7 七叶一枝花不同种质资源的农艺性状变异系数Table 7 Coefficients of variation of agronomic characteristics of different Paris polyphylla var.chinensis resources

主成分分析如表8 所示，12 个主要农艺性状前4 个特征根的累积贡献率达80.080%，说明12 个主要农艺性状的相关信息可由前4 个主成分概括。第1 主成分的特征根是4.073，方差贡献率为33.938%，株高的特征向量值最大，其次是叶宽，说明株高和叶宽对第1 主成分的影响大(表9)。第2 主成分的特征根是2.787，方差贡献率为23.227%，根茎直径的特征向量值最大，其次是根系长，说明根茎直径和根系长对第2 主成分影响最大(表9)。第3 主成分的特征根是1.656，方差贡献率为13.800%，根茎长的特征向量值最大，其次是叶数，说明根茎长和叶数对第3 主成分的影响最大(表9)。第4 主成分的特征根是1.094，方差贡献率为9.115%，以刻痕的特征向量值最大，其次是叶长，说明刻痕和叶长对第4主成分的影响最大。第1、2、3 和4 主成分为产量因子，增大4 个主成分值，可以增加七叶一枝花资源的产量。

表8 七叶一枝花资源农艺性状相关性主成分分析Table 8 Analysis of principal components of agronomic traits correlation of Paris polyphylla var. chinensis resources

表9 前4 个主成分对应的特征向量Table 9 The feature vector corresponding to the first 4 principal components

2.5 不同资源的七叶一枝花根茎有效成分变化

前期已测定第二年长势较好的49 份七叶一枝花资源的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ以及4 种重楼皂苷的总含量，不同重楼资源的皂苷种类及含量没有明显的区域性区别，来自四川省峨眉山市、贵州省贵阳市花溪桐木岭、福建省三明市泰宁县大田乡、福建省三明市建宁县均口镇、福建省三明市明溪县盖洋镇、福建省龙岩市连城县宣和乡、福建省龙岩市长汀县馆前和福建省光泽县寨里镇8 处的资源可以检出4 种重楼皂苷。符合2020 年版《中国药典》重楼皂苷总含量的资源有27 份，占55%，资源编号分别是3、7、8、10～21、27、29、32、40～43、45～47、49、113。重楼皂苷Ⅶ、Ⅵ、Ⅱ和Ⅰ的变异系数分别为57.52%、246.82%、170.50%和296.83%，说明七叶一枝花资源根茎重楼皂苷含量变异丰富，选择范围较大(表10)。

表10 七叶一枝花资源根茎重楼皂苷含量变异系数Table 10 Coefficient of variation of Rhizoma Paridis saponin content

2.6 七叶一枝花适应性综合评价

2.6.1 评分项目与计分标准

根据上述各性状主成分分析和聚类分析结果，取物候期、抗病性、农艺性状、有效成分中对主成分影响较大的12 个性状作为评价指标，每个指标分级计分如表11。

每份种质资源的总得分越高则适应性越强，适宜推广；反之则弱，不宜推广种植。适应性分级如下：

1 级：总计评分≥54 分(共12 个指标，总分60分)，适应性较强，可直接大面积推广。

2 级：总计评分介于48～53 分，适应性较强，可开发利用。

3 级：总计评分介于36～47 分，适应性中等，有些个别项目不符合标准，可根据其具体的特点，或采取一定措施，在适宜其生长的环境中应用。

4 级：总计评分<36 分，适应性较差，有较多指标都比较差，不适宜推广。

2.6.2 综合评分

根据本文建立的七叶一枝花适应性综合评价标准，在福建种植期间，综合评分大于50 分的资源有6 份，经鉴定均为七叶一枝花(表12)。其中有4 份资源≥54 分，说明适应性较强，可根据具体情况直接利用。

表11 七叶一枝花资源适应性评价性状指标及计分标准Table 11 Character index and scoring standard of adaptability evaluation for P.polyphylla var.chinensis resources

表12 综合评分大于50 分的6 份资源Table 12 Six resources with comprehensive evaluation score greater than 50 points

3 讨论

引种七叶一枝花栽培成功的判断标准是在本地种植年限在2 年以上，可正常开花结果和越冬，即种群可以自然更新。相似经纬度及地形地貌的资源才能够正常生长，具有完整物候期。不同区域重楼资源在福建省种植时物候期和农艺性状表现差异性最大，华南地区重楼资源2 月上旬开始出苗，植株地上部年生长时间为290 d 左右，有完整的物候期，农艺性状也能表现出资源在原产地的特性。云南、四川和贵州等地的重楼资源在福建省种植第二年有80%没有出苗，20%的出苗期推迟到5 月1 日后，植株地上部长势弱且过早枯萎，两至三年后地下部根茎腐烂，全株死亡。经多年实地调研及生产实践摸索分析导致南方低山丘陵区域引种云贵川品种失败的主要原因有：1)重楼资源对环境条件和种植技术要求较高；2)闽赣浙南方低山丘陵区域与云贵高原和四川盆地在地形、气候和环境因子上差异较大，陈士林等[9]研究发现云南重楼的最大生态相似度区域主要包括云南、四川、贵州、湖北和湖南等省；3)闽赣浙夏季高温多雨、春季低温多雨和土壤有机质少且黏性重等原因导致南方低山丘陵区域的重楼病虫害较多，且病虫害种类及发生规律、物候期和管理技术等方面与云贵川地区具有较大差异。

49 份资源的皂苷种类及含量差异较大，符合2020 年版《中国药典》的重楼皂苷总含量有27份资源，占55%，有8 份资源含有重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ4 种重楼皂苷，其中46 份资源的偏诺皂苷总含有量占总皂苷比例的50%以上。陈铁柱等[10]研究发现四川、湖北和广西等21 个产地七叶一枝花中皂苷含量符合《中国药典》的仅占14.3%，有18 个产地的七叶一枝花的偏诺皂苷总含有量占总皂苷比例的50%以上；李海涛等[11]研究发现滇东南、滇南、滇西和滇中22 个产地的云南重楼中皂苷含量符合《中国药典》的仅占27.3%；周爱存等[12]研究发现浙江省七叶一枝花的重楼皂苷含量符合《中国药典》的低于50%。

七叶一枝花资源的病害(灰霉病、叶斑病和茎腐病)、农艺性状(根茎鲜重、根系鲜重和叶柄长)和重楼皂苷含量(重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ和Ⅵ)存在着广泛的变异，变异系数均超过50%，说明七叶一枝花资源的这些指标变异丰富，可作为良种筛选的有效指标。各性状主成分分析和聚类分析结果表明影响较大的4 项评价指标是物候期、抗病性、农艺性状和重楼皂苷含量，分别列出5 个评分等级(5、4、3、2、1 分)，每份种质资源的总计得分越高，说明适应性越强，越适宜推广。南方低山丘陵区域选择七叶一枝花种质资源时，应综合考虑资源的生物学特性和自然条件(海拔、光照、湿度和土壤等)等，筛选获得适宜当地种植的优质七叶一枝花品种，培育道地药材。