二维液相色谱识别黄果野鸦椿及其原变种

黄怡晴，邢 云，刘顺治，范世明，蔡邦平，丘鹰昆*

(1.厦门大学，福建 厦门 361105；2.福建中医药大学，福建 福州 350122；3.厦门园林植物园，福建 厦门 361003)

黄果野鸦椿(Euscaphis japonicavar.wupingensis)是省沽油科野鸦椿属植物[1]，其原种野鸦椿(E.japonica)在福建已广泛种植，资源十分丰富，野鸦椿的果具有消肿止痛、温中理气的功效[2—3]。

其与原种野鸦椿的主要区别是果皮颜色不同，黄果野鸦椿的果皮为黄色，原种野鸦椿的果皮为红色[4]。不同品种植物代谢产物的化学成分差异，对植物分类与鉴别具有一定的辅助与验证意义。

二维色谱是通过一定的接口技术，将有两种不同分离机制的色谱柱进行串联，样品在经过第一维色谱柱分离之后，在接口处，经过浓缩、富集、切割等方式，进入第二维色谱柱，进行二次分离，在线二维色谱比一维色谱更为有效[5—6]。本文采用二维液相色谱分析黄果野鸦椿及其原变种的代谢产物差异，为二者的化学鉴别提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野鸦椿和黄果野鸦椿成熟的果皮，采自厦门园林植物园。样品标本贮藏于厦门园林植物园标本室，标本号3621 和4031。

二维液相色谱基于安捷伦1100 型液相色谱仪构建(Agilent 1100，Agilent Technologies Inc.,Santa Clara 美国)；甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，Fairfleld，CT，美国)，Kinetex XB-C18 色谱柱(50 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，Phenomenex，美国)，Cosmosil C18-PAQ色谱柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，Nakalai Tesque，日本)，Cosmosil C18-PAQ 富集柱(10 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，Nakalai Tesque，日本)。

1.2 供试液制备

称取干燥药材100 mg，置于2 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，超声提取30 min。使用0.22 μm 微孔膜过滤，滤液保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3 一维色谱分析条件

野鸦椿、黄果野鸦椿果皮的供试品溶液，分别用Cosmosil C18-PAQ 色谱柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)进行一维色谱分析，以比较其代谢产物差异。HPLC 分析条件如下：进样量5 μL；流动相甲醇(B)/水(A)；洗脱程序：0→30 min，0% B→100% B；流速1.0 mL·min-1；柱温常温；检测波长254 nm。

1.4 RPLC×RPLC 二维液相色谱分析条件

1.4.1 第1 维色谱参数

色谱柱：Kinetex biphenyl 联苯基柱(250 mm ×4.6 mm i.d.，5 μm)；进样量20 μL；流动相甲醇(B)/水(A)。洗脱程序：0→300 min→320 min，5%B→100% B→100% B；流速0.1 mL·min-1；室温；波长254 nm。

1.4.2 稀释–吸附接口参数

稀释液：0.1%甲酸/水；吸附柱：Cosmosil C18-PAQ 富集柱(10 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；稀释倍数3 倍；阀切换时间5 min。

1.4.3 第2 维色谱参数

色谱柱：Kinetex XB-C18 柱(50 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；流动相乙腈(B)/水(A)；洗脱程序：0→4.0 min→4.1 min→5.0 min，0% B→45% B→0% B→0% B；流速3 mL·min-1；室温；波长254 nm。

1.5 RPLC-RPLC 中心切割二维色谱分析条件

1.5.1 第1 维色谱参数

色谱柱：Kinetex biphenyl 联苯基柱(250 mm ×4.6 mm i.d.，5 μm)；进样量：20 μL；流动相甲醇(B)/水(A)；洗脱程序：0→30 min，5% B→100% B；流速1 mL·min-1；温度室温；波长254 nm。

1.5.2 中心切割参数

切割时段：14～17 min；稀释液0.1%甲酸/水；吸附柱Cosmosil C18-PAQ 富集柱(10 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；稀释倍数3 倍。

1.5.3 第2 维色谱参数

Cosmosil C18 色谱柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；流动相乙腈(B)/水(A)；洗脱程序：0～30 min，0%～45%B；流速1 mL·min-1；室温；波长254 nm。

2 结果与分析

2.1 一维液相色谱(C18 色谱柱)分析

如图1 所示，黄果野鸦椿、野鸦椿果皮1D-HPLC的分析可以看出，二者的代谢产物极其相似，仅仅依靠一维液相色谱难以区分二者的差异。

2.2 二维色谱系统分析条件的优化

单纯使用一维色谱分析难以区分黄果野鸦椿、野鸦椿的差异，进一步采用RPLC×RPLC 二维液相色谱体系进行分析，在二维色谱中组合不同分离机制的反相色谱柱，以获得更加理想的分离效果。

考察不同型号色谱柱，从中选择分离效果好，与第2 维C18 色谱柱具有分离差异的作为第1 维的色谱柱。结果表明，Kinetex biphenyl 联苯基柱的分离效果最好，色谱峰的数量最多，故选择Kinetex biphenyl 联苯基柱作为二维色谱的第1 维色谱柱。

Phenomenex 公司的Kinetex 系列核壳色谱柱，具有背压低、理论塔板数高的优点，基于样品特点，本实验选择Kinetex XB-C18 色谱柱(50 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)作为第2 维色谱柱。由于第2 维色谱柱采用较高的分析流速(3 mL·min-1)，因此流动相选择压力更低的乙腈/水体系。

2.3 黄果野鸦椿及其原变种的RPLC×RPLC 二维色谱分析

运用上述优化的色谱条件对黄果野鸦椿及其原变种供试液样品进行RPLC×RPLC 二维色谱分析。样品经第1 维色谱分离，每5 min 切割成一段，在稀释–吸附接口的参与下，送入第2 维进一步分离，黄果野鸦椿及其原变种的RPLC×RPLC 二维色谱分析如图2 所示。两者的RPLC×RPLC 二维色谱分析图谱较为相似，绝大多数成分仅有含量上的差异。但在第1 维萘基柱分析时间的约150 min 处，其组分进入第2 维分离时显示，含有较为明显的差异性成分(图2)。

图1 黄果野鸦椿和野鸦椿果皮甲醇提取液一维液相图Fig.1 1D-HPLC analysis of the peer of Euscaphis japonica var. wupingensis and E.japonica

图2 黄果野鸦椿及其原变种的RPLC×RPLC 二维色谱分析图谱Fig.2 The 2D RPLC×RPLC separation of the peer of Euscaphis japonica var.wupingensis and E.japonica

2.4 黄果野鸦椿及其原变种的RPLC-RPLC 中心切割二维色谱分析

鉴于差异性的成分在萘基柱上较为集中(总分析时间约50%前后)，因此可以采用中心切割方式，先用萘基柱对差异成分进行富集，再进行C18 柱分离。从图3 可见，黄果野鸦椿及其原变种有3 个较为显著的差异成分。黄果野鸦椿供试液在23.39 min出峰，而野鸦椿并未检出该色谱峰；野鸦椿的供试液在20.56 min、24.96 min 有其特征峰，而黄果野鸦椿中则未检出。

图3 黄果野鸦椿及其原变种的RPLC-RPLC 中心切割二维色谱图普Fig.3 Heart-cutting RPLC-RPLC analysis of the peer of Euscaphis japonica var.wupingensis and E.japonica

3 讨论

野鸦椿属的分类一直存在争议[7—8]，近年来，不少学者尝试将分子生物学等技术手段与形态识别相结合，以突破传统鉴定方法的局限[9—10]。

采用在线二维色谱手段能够将黄果野鸦椿及其变种甲醇提取物之间细微的化学差异鉴别出来。根据黄果野鸦椿果皮甲醇提取液和野鸦椿果皮甲醇提取液的化学成分检测，黄果野鸦椿及其原变种有3个较为显著的差异成分，为黄果野鸦椿作为野鸦椿的变种的鉴别提供化学辅助手段。

由于两者之间的差异较小且在线二维色谱分析上样量有限，未能直接通过在线二维色谱分析手段将其成分鉴定出来，后续需要其他分析手段进一步分析。