编织型丝素纤维人工韧带及其体外降解性能研究

吴佳蔚，刘明洁，王璐，关国平

东华大学纺织学院，纺织面料技术教育部重点实验室(上海, 201620)

0 引言

韧带是一种致密的结缔组织纤维束或膜， 用以连接关节处的骨或软骨， 主要由I型胶原组成， 还有少量的III型胶原[4]。韧带损伤是一种常见及高发疾病， 韧带常由于非生理性的受力活动而造成不同程度的断裂或缺损。当韧带受损较严重， 无法通过自身能力修复时， 就需要韧带移植。常用的韧带移植物有自体移植物、 同种异体移植物和人工韧带材料。自体和同种异体移植物虽然取材方便， 尺寸和相容性好， 但存在供体不足， 并发症， 疾病传播风险， 质量不稳定等诸多不足。

人工韧带的出现， 为韧带移植带来了新选择。临床上曾经使用较为广泛的人工韧带是以聚酯材料为基础的LARS(Ligament Advanced Reinforcement System)韧带[12， 1]。然而， 由于聚酯材料的不可降解性及生物学惰性， LARS人工韧带并不具备可降解性、 骨传导性和骨诱导性， 中长期效果并不理想， 临床应用越来越少。因此， 开发高强度、 可降解、 能帮助人体自身韧带再生的人工韧带产品， 目前是该领域研究的热点和难点。

丝素纤维来源于天然蚕丝， 生物相容性好， 生物可降解， 力学性能优良。丝素纤维编织缝合线应用临床已有近百年的历史。因此， 丝素纤维是编织人工韧带最有前景的原材料之一。本研究设计并制备了一种编织基丝素纤维人工韧带材料， 对其在PBS和酶溶液条件下的体外降解性能进行了研究， 以期能为最终开发理想的高强度、 可降解人工韧带产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 丝素纤维人工韧带制备

在12锭编织机上， 运用逐级编织的方法获得丝素纤维人工韧带(图1)。首先， 用2根股线合股得到1根复丝， 运用复丝进行编织得到一束编织纱。用0.5%的Na2NO3溶液对编织纱脱胶三次， 每次30 min， 脱胶温度95 ℃[7，21]。随后， 将脱胶好的编织纱用12锭编织机继续编织， 得到丝素纤维人工韧带(silk fibroin fiber artificial ligaments, SFALs)材料。

图1 丝素纤维人工韧带材料制备流程图Fig.1 Schematic drawing of the preparation process of the silk fibroin fiber artificial ligaments (SFALs)

1.2 丝素纤维人工韧带材料的PBS降解

所有SFAL样品经环氧乙烷灭菌备用。配制pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为基本降解液， 高压蒸汽灭菌后备用。其他材料和工具经紫外线照射灭菌。所有操作均在超净工作台中完成。将4根样品(每根长5 cm)及40 mL PBS放入50 mL的离心管中， 在37 ℃、 60 rpm的振荡恒温箱中孵育。每7天更换一次PBS， 换液时测定降解后PBS的pH值。分别在降解不同的时间点后取出样品， 每次取出4根。用去离子水冲洗3次， 滤纸吸干表面水分后， 放入培养皿中于-20 ℃冰箱保存。待所有试样取出后， 冷冻干燥后备用。

1.3 丝素纤维人工韧带材料的酶降解

本研究选择蛋白酶XIV(Protease type XIV Bacterial From Strepto,Sigma)来降解SFAL[17，3]。酶降解液是指含1 mg/mL蛋白酶XIV的PBS溶液， 过滤灭菌， 即配即用。除酶降解液外， 试样、 试剂、 材料灭菌及其他处理方法同上。

1.4 表征

1.4.1 扫描电镜(SEM)

取SFAL样品中段， 用导电胶固定在电镜台上并喷金处理。使用TM 3000型扫描电子显微镜观察。加速电压为10 kV。

1.4.2 质量损失

样品干燥后置于恒温恒湿环境下24 h， 称量降解前后的样品质量， 计算质量损失率：

其中，w1是指降解后样品质量(mg)，w0是指样品初始质量(mg)。

1.4.3 降解液变化

在PBS和酶降解过程中， 随时观察降解液的变化， 并测降解后溶液的pH值。

1.4.4 力学性能

对PBS和酶降解后的试样分别进行轴向拉伸性能测试， 每个时间点的样品重复测试3次。测试参数如下： 隔距为20 mm， 拉伸速度为24 mm/min， 预加张力为0.5 N， 松式夹持。

2 结果与讨论

2.1 SFAL表面形貌

不同降解条件下、 不同降解天数的SFAL样品实物照片和扫描电镜图如图2所示。从图2可看到两种样品表面形貌和结构存在差异。在1 mg/mL蛋白酶溶液中降解21天， SFAL表面开始出现少数纤维的断裂。到第42天时， 断裂的纤维数量增加。到第70天时， 表层大多数纤维均有断裂， 且在单根纤维上可见多处酶蚀痕迹。表层结构大体破坏， 但纤维束的整体结构基本保持完整。而经PBS降解的SFAL样品， 直到第70天， 都未见纤维的断裂及整体结构的破坏。

图2 SFAL样品在不同降解条件及降解天数下的SEM图片Fig.2 SEM micrographs of SFAL samples under distinct degradation conditions over time

2.2 质量损失

SFAL样品在两种不同降解条件下的质量损失情况如表1所示。可以看到， 蛋白酶XIV降解7天的时候， SFAL的质量没有出现明显的变化， 质量损失率为1.0 %。在第14天时， SFAL的质量损失率上升到4.4%。随着降解时间的增加， 在第70天时质量损失率为18.4%。这是PBS降解70天时质量损失率(1.4%)的13倍。同时， 使用台式测厚仪测量初始和降解70天时SFAL样品的直径发现， 蛋白酶XIV降解的SFAL直径从(3.133±0.159) mm下降到(2.449±0.173) mm， 下降了约21.8%。

表1 SFAL样品在不同降解条件下的质量损失率(%)Tab.1 Mass loss rate of SFAL samples under different degradation conditions

2.3 降解液变化

新鲜的PBS和降解后的PBS均是无色透明的， 肉眼未见明显变化。但在PBS降解70天后， PBS中有极微量的颗粒物。结合SEM结果分析， 由于SFAL中部的显微图片并未观察到纤维降解迹象， 因此这些碎屑可能来自于纤维端部。新鲜的酶降解液呈淡黄色， 降解后溶液变浑浊。从第7天开始， 降解后酶溶液中便有絮状物存在， 且自21天开始絮状物逐渐增多， 如图3所示。

图3 新鲜降解液与降解后溶液照片Fig.3 Gross view of the fresh solutions and the degraded solutions

丝素纤维的降解产物主要是肽链或氨基酸。有文献表明， 蛋白酶产生的降解产物中游离氨基酸的比例超过了总降解产物的50%， 主要包括天冬氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 缬氨酸、 丙氨酸、 半胱氨酸、 异亮氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸， 这些游离氨基酸会使溶液呈弱酸性[11]。本研究中， 降解液的pH变化如图4所示。降解后PBS的pH值基本保持稳定， 在pH7.3上下浮动， 这也说明在PBS条件下丝素纤维保持稳定、 降解缓慢， 到70天时仍未出现明显降解。而在蛋白酶作用下， 21天后溶液pH下降至6.7左右， 随后pH基本保持在6.6 - 6.8之间， 这可能是由于酶加速降解产生游离氨基酸， 使降解后酶溶液pH略有下降， 呈弱酸性。

图4 降解液pH值变化Fig.4 pH Changes of the degraded solutions

2.4 力学性能

PBS条件下的SFAL样品的最大断裂强力没有明显变化， 基本保持在240 N左右。而酶降解液降解后的SFAL的最大断裂强力明显下降， 由第1天的(228±29) N下降到第70天时的(111±8) N， 下降了约50%(见图5)， 说明酶降解对丝素纤维力学性能的影响很大。同时， 对酶降解曲线做方程拟合可以发现， 最大断裂强力随时间呈指数下降(R2=0.89)， 也符合之前学者的相关研究结果[17]。

图5 不同降解条件下SFAL样品最大断裂强力的变化Fig.5 The ultimate tensile force of the SFAL samples under distinct degradation conditions over time

2.5 讨论

酶在丝素蛋白纤维的降解中发挥着重要作用。生物材料的酶降解分为两步： 第一步是酶通过表面结合域在底物表面吸附， 第二步是化学键的水解[8-9]。作为天然高分子蛋白， 丝素纤维容易被蛋白水解酶所降解， 常用的酶包括蛋白酶XIV、 α-糜蛋白酶和胶原酶IA等[4]。不同的酶对SF的降解速率影响程度不一样。Li等研究了多孔再生丝素蛋白膜的酶加速降解行为， 对浓度相同的胶原酶IA、 蛋白酶XIV和α-糜蛋白酶的降解能力进行了对比。三种酶降解后的产物平均分子量大小依次为蛋白酶XIV< 胶原酶IA < α-糜蛋白酶。到第15天时， 蛋白酶XIV作用下70%的SF膜已降解 。Thidarat等报告了天然和PEG化丝纳米粒子在蛋白水解酶(蛋白酶XIV和α-糜蛋白酶)、 木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)条件下为期20天的降解反应。结果表明， 两种丝纳米粒子表现出相似的降解行为， 降解速率排序如下： 蛋白酶XIV>木瓜蛋白酶>α-糜蛋白酶[3]。Chen等研究了碱性蛋白酶、 α-糜蛋白酶、 胃蛋白酶和胰蛋白酶的对家蚕和柞蚕SF的降解过程。结果表明， 这四种酶对SF二级结构有相似的水解作用， 而家蚕和柞蚕SF的变化主要表现为β-折叠和α-螺旋结构的减少。

SF材料本身的化学结构(蚕丝来源、 天然或再生SF、 基团组成等)、 微观结构(微原纤的排列、 表面拓扑结构等)和宏观结构(尺寸、 成型方式等)对降解速率也有影响[7-8]。You等对桑蚕丝和非桑蚕丝来源的再生SF支架进行了降解行为比较。体内试验表明， 在酶作用下， 非桑蚕丝来源的再生SF支架比桑蚕丝来源的再生SF支架降解更慢， 这是由于非桑蚕丝来源的再生SF支架有着更多的(-Ala-)n重复序列、 致密的晶体结构以及高α-螺旋和β-折叠含量[1]。许多研究也表明， 水不溶性的silk II和水溶性的silk I对SF的降解速率有很大影响[8，4]。随着β-折叠结构的数量增加， 降解时间也随之延长。以无定形结构为主的再生丝素材料降解较快， 而晶区较多的天然丝素纤维降解较缓慢。

大多数蛋白水解酶都能很好地降解低分子量和非致密结构的丝素蛋白， 这说明降解行为与丝生物材料的分子量和结构密切相关。聚合物的结构和分子量是影响降解过程的两个主要因素。低分子量和非致密结构意味着酶很容易在丝表面结合， 表现出水解行为[11]。

本研究所选用的材料为天然蚕丝， 将其脱胶处理后得到SF纤维， 经编织得到SFAL。综合试验结果， PBS直到第70天才出现微量颗粒物， 而其他结果均未发生明显改变。这就说明SFAL在PBS中降解缓慢。而酶降解液在第7天时便有少量絮状物出现， 推测是SFAL样品两端有少量纤维降解。第14天， 质量损失开始变得明显， 但其他方面没有明显变化。SEM照片中未观察到纤维断裂， 推测质量损失主要来自样品两端纤维的降解。第21天时， 纤维的表面形态、 质量损失、 降解液的pH值和絮状物的数量以及力学性能， 都出现了明显改变。说明在蛋白酶XIV作用下， SFAL开始主体部分的降解， 纤维表面微观形貌的破坏与SFAL力学性能的下降情况相吻合。到第70天时， SFAL中的纤维多处断裂， 质量损失率高达18.4%， 直径下降了21.8%， 最大断裂强力损失了50%。降解后酶溶液pH下降到7以下， 且可见絮状物存在， 降解效果明显。由于断裂的纤维使SFAL有更多的表面暴露出来， 为蛋白酶提供了更多的作用位点。因此， 降解加快导致力学性能下降也加快。

在人工韧带的研究中， 降解性能是非常重要的性能。如何预测并调控植入物的降解速率与降解周期， 是研究植入物降解性能的关键。植入物的降解速率应与所植入部位组织的再生速率相匹配。随着组织再生， 植入物逐步降解， 实现理想修复的目标。SF的降解产物主要为游离氨基酸， 可以被机体吸收， 这在生物医用领域是很有利的。据文献报道， 蚕丝纱线在植入体内后约5个月失去100%的抗拉强度[3]。然而， 降解速率可以通过支架设计和表面改性而改变。在体内组织再生的过程中， 或材料在体内承受负荷时， 材料的降解速率可能发生变化[17]。本研究中， 对酶降解条件下和力学性能变化曲线进行了数学拟合。结果与已有的研究结果相一致。因此， 本研究结果可以为预测SFAL的体内降解行为提供参考。

3 结论

本研究以SFAL为研究对象， 探讨了PBS和酶溶液条件下SFAL的降解行为。结果表明， 70天内， PBS未能使SFAL发生明显变化。而蛋白酶XIV则明显加速了SFAL的降解。在蛋白酶XIV的作用下， 随着时间的推移SFAL发生了纤维断裂、 质量损失率增加、 力学性能下降及降解液的pH变化。本研究初步探索了SFAL的PBS与酶溶液降解行为差异。结合未来体内降解试验结果， 可进一步建立体内外降解性能之间的关系， 可为开发降解性能和力学性能可控的SFAL产品提供参考。