含L-精氨酸和抗氧化物质组方的毒理学安全性研究

赵燕，赵保路

1(哈尔滨工业大学(威海)生物工程系，山东 威海，264209)2(中国科学院,生物物理研究所，北京，100101)

L-精氨酸是一种非必需碱性氨基酸，主要来源于饮食、蛋白质降解和自身合成，在体内合成速度较慢，具有增强免疫力、保护胃黏膜、促进蛋白合成等生理功能[1-3]，但对于婴幼儿为必需氨基酸，可以起到一定的解毒作用。L-精氨酸增强免疫力的重要作用机制为精氨酸—一氧化氮(nitric oxide, NO)调控模式。L-精氨酸经一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)催化生成具有生物活性的NO。NO在生物体内承担着重要的生物功能，包括抗炎、降血压、舒张血管等[4-7]。

天然抗氧化物剂含有大量能清除过量自由基的抗氧化成分，如山楂提取物、知母提取物、虾青素等，具有辅助保护心血管、调节免疫、抗氧化、降血糖等功能[8-9]。山楂提取物含有黄酮、原花青素、三萜酸等抗氧化物质，具有保护心血管、抗氧化、抗炎等作用[10]，知母宁具有清热泻火，滋阴润燥，退热消炎，抑菌杀菌，降血糖等功能[11-12]。虾青素属类胡萝卜素，是存在于鱼、虾和藻类中的一种强抗氧化剂，其抗氧化活性高于β-胡萝卜素的10倍、VE的100倍[13]。

该研究重点开展了含L-精氨酸和抗氧化物质(山楂提取物、知母提取物和虾青素)组方的安全性毒理学评价，以期为其临床应用及保健食品研发提供毒理学方面的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

组方样品由L-精氨酸(L-Arg)、山楂提取物、知母提取物和虾青素为原料，按质量比1∶1∶2∶2制成。敌克松(dexon)，上海晶纯试剂有限公司；2-氨基芴，上海晶纯试剂有限公司；1,8-二羟基蒽醌，Sigma-Aldrich公司；美国胎牛血清，浙江天航科技有限公司；环磷酰胺，Sigma-Aldrich公司；Giemsa染料，salarbio公司；甲醇，天津市康科德技术有限公司；羧甲基纤维素钠，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BP211D电子天平、BS323S电子天平、BSA42002S电子天平，德国Sartorius公司；BX51生物显微镜，Olympus公司； BSC-1360ⅡA2生物安全柜，北京中联哈尔仪器有限公司；ADVI2120i血液分析仪，西门子公司。

1.3 动物饲养和处理

SPF级雄性ICR小鼠、SD大鼠,济南朋悦实验动物繁育有限公司,饲养于屏障级动物房，温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%，照明时间12 h。设毒理组和对照实验组，分溶剂对照组和样品低、中、高3个剂量组，每组10只动物。

1.4 剂量选择及受试物给予方式

1.4.1 急性毒性试验

L-精氨酸和天然抗氧化剂组方样品,按相当于人体剂量的750倍，即20.0 g/(kg·BW)，连续经口灌胃14 d。记录动物中毒表现和死亡情况，试验结束后进行剖检并记录大体解剖结果。

1.4.2 Ames试验

设8、40、200、1 000和5 000 mg/皿，5个剂量，称取1.25 g样品，加灭菌注射用水至25 mL，混匀，在0.055 MPa条件下灭菌20 min，4 ℃保存，临用时，加灭菌注射用水按1∶4体积比依次稀释成50 000 (不稀释)、10 000、2 000、400、80 mg/mL，试验时，每皿加入各个试剂组样品0.1 mL。

1.4.3 骨髓细胞微核试验

试验设样品组、溶剂对照组和阳性对照组，L-精氨酸和天然抗氧化剂组方样品组按低、中、高3个剂量，分别为2.5、5.0和10.0 g/(kg·BW)，用5 g/L羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)溶液配制成0.125、0.25和0.5 g/mL混悬液。阳性对照组经灌胃给予2.0 mg/mL的环磷酰胺溶液，总剂量为40.0 mg/(kg·BW)。溶剂对照组给予0.5% CMC-Na溶液。经口灌胃容积均为20 mL/(kg·BW)。

1.4.4 小鼠精子畸形试验

试验设样品组、溶剂对照组和阳性对照组，L-精氨酸和天然抗氧化剂组方样品组按低、中、高3个剂量，分别为2.5、5.0和10.0 g/(kg·BW)，用5 g/L CMC-Na溶液配制成0.125、0.25和0.5 g/mL混悬液。阳性对照组经灌胃给予2.0 mg/mL的环磷酰胺溶液，总剂量为40.0 mg/(kg·BW)。溶剂对照组给予5 g/L CMC-Na溶液。经口灌胃,给予容积均为20 mL/(kg·BW)。连续给予5 d，首次给予后第35天处死小鼠。

1.4.5 大鼠喂养试验

30 d喂养SD大鼠组方样品，以0.67、1.33和2.67 g/(kg·BW)(相当人体推荐量的25、50和100倍) 3个剂量掺入饲料，大鼠摄入饲养量按10 g/(100 g·BW)计，掺入质量分数分别为0.67%、1.33%和2.67%，采用逐级放大法将样品掺入饲料中。空白对照组喂食不添加组方样品的普通饲料。

1.5 实验方法

1.5.1 急性毒性试验

小鼠检疫合格后，取试验小鼠20只，雌雄各半，禁食不禁水16 h后，经灌胃给予质量浓度为0.5 g/mL试验样品20 mL/(kg·BW)，1 d内给予2次，2次间隔时间4 h，每天观察1次，观察14 d，记录动物中毒表现及死亡情况。试验结束后进行剖检并记录大体解剖结果。

1.5.2 Ames试验

采用平板掺入法，将冷冻保存的实验菌株TA97、TA98、TA100、TA102分别接种于营养肉汤培养基10 mL, 37 ℃振荡(100次/min)培养10 h。将含组氨酸(0.5 mmol/L)、生物素(0.5 mmol/L)的顶层培养基2 mL分装于试管中，50 ℃水浴保温，然后每管依次加入0.1 mL实验菌株液，0.1 mL样品溶液和S9混合液0.5 mL(需代谢活化时)，充分混匀，迅速倾入底层琼脂板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37 ℃培养箱孵育48 h，计数每皿回变菌落数。每个剂量均做3个平行板，同时设空白对照组、溶剂对照组和阳性对照组。

1.5.3 小鼠骨髓细胞微核试验

采用ICR小鼠50只，雌雄各半，雄性体重25.68～28.91 g，雌性体重26.24～29.12 g。实验设置对照组和阳性对照组。样品组设低、中、高3个剂量，经口灌胃，采用30 h/2次给予法，2次间隔24 h，第2次给予后6 h取材。首末给予均称动物重量并记录。动物颈椎脱臼法处死小鼠，取胸骨，用止血钳挤出骨髓液与载玻片一端的胎牛血清混匀，常规涂片。空气干燥后，用甲醇固定10 min。将固定好的涂片放入Giemsa应用液中，染色10 min，用水轻轻冲洗，凉干。在光学显微镜下，观察200个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，同时计数正染红细胞(normochromatic erythrocyte，NCE)，计算观察PCE/NCE比值，每只动物计数1 000个嗜多染红细胞。观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。

1.5.4 小鼠精子畸形试验

采用ICR小鼠25只，雄性，体重25.68～28.91 g。实验设置对照组和阳性对照组。样品组设低、中、高3个剂量，经口灌胃，连续给予5 d，首次给予后第35 d处死小鼠。颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧附睾，放入盛有约1 mL生理盐水的小烧杯中，用眼科剪纵向剪1～2刀，静止3 min，轻轻摇动。用4层擦镜纸过滤，滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定5 min，晾干后用1%伊红染色1 h，用水轻轻冲洗，干燥。用低倍镜下找到背景清晰，精子重叠较少的部位，用高倍镜检查精子的形态。精子畸形按照无钩、香蕉形、胖头、无定型、双头、双尾、尾折叠进行记录。每只动物检查1000个精子。记录畸变的类型和数量，计算精子畸形率。

1.5.5 大鼠喂养试验

检疫合格后，取试验动物L-精氨酸和天然抗氧化剂组方对人体推荐量为l.6 g/60 (kg·BW)。动物受试物毒理实验剂量按人体推荐的25、50和100倍3个剂量掺入饲料，饲喂SD大鼠30 d。第31天后，在禁食16 h称重。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，处死动物，取肝、脾、肾、睾丸、卵巢等脏器和胸腺称重，计算脏/体比值；将肝、脾、肾、睾丸、卵巢等脏器固定保存好，并进行病理检查。取血进行血液指标测定包括血红蛋白(hemoglobin，HGB)浓度、红细胞(red blood cell，RBC)数、白细胞(white blood cell，WBC)数、嗜中性粒细胞(neutrophils，NEU)百分率、淋巴细胞(lymphocyte，LYM)百分率、单核细胞(monocyte，MONO)百分率、酸性粒细胞(eosinophil，EOS)百分率和嗜碱性粒细胞(basophils，BASO)百分率；以血清生化指标测定包括谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、血糖(glucose，GLU)、肌酐(creatinine，CREA)、尿素(urea，UREA)、总胆固醇(total cholesterol，TCHO)和甘油三酯(triglyceride，TG)。

1.6 统计分析

采用SPSS 19.0统计软件以X2检验进行数据处理，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

1.7 评价标准

根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[14]，每个剂量组与溶剂对照组分别进行比较，畸变率为溶剂对照组的2倍及以上有统计学差异，并有剂量反应关系，可判断为实验结果阳性。

2 结果与分析

2.1 小鼠急性毒性试验

小鼠在观察期内未出现死亡及中毒状况，该组方样品急性经口小鼠试验最大耐受剂量(maximum tolerated doses，MTD)均>20.0 g/(kg·BW)(表1)，结果显示该组方属无毒级。

表1 急性毒性实验结果

2.2 Ames试验

如表2所示，2次试验中组方各剂量在加和不加S9条件下各菌株回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，各剂量组间亦无剂量反应关系。因此，在加和不加S9的条件下，组方对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102共4株菌株均未呈现遗传毒性；即在本试验条件下，在加与不加代谢活化系统的情况下，该组方对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阴性。

表2 Ames试验结果

注：-表示无(下同)

2.3 小鼠骨髓细胞微核试验

如表3所示，组方各剂量PCE/NCE比值未少于溶剂对照组的20%，表明该组方在实验剂量下无细胞毒性。环磷酰胺阳性对照组与溶剂对照组相比，微核率有较显著性差异(P<0.01), 而组方各剂量组微核率与溶剂对照组相比无显著性差异(P>0.05)。因此，在该实验条件下，该组方不会引起小鼠的骨髓嗜多染红细胞突变作用。

表3 骨髓细胞微核试验结果

注：**表示与溶剂对照组比较,P<0.01(双侧t检验)(下同)

2.4 小鼠精子畸形试验

如表4所示，组方各剂量组小鼠精子畸形率与溶剂对照组相比，无显著性差异(P>0.05)。环磷酰胺阳性对照组与溶剂对照组相比，有较显著性差异(P<0.01),因此，在该实验条件下，该组方对小鼠精子畸形试验结果为阴性。

表4 小鼠精子畸形试验结果

2.5 大鼠30 d喂养试验

L-精氨酸和天然抗氧化剂组方按人体推荐量的25、50和100倍3个剂量掺入饲料，饲喂SD大鼠30 d，未发现与对照有显著改变。30 d后处死动物，取肝、脾、肾、睾丸、卵巢等脏器和胸腺称重。如表5和表6所示，3个剂量组动物的体重以及脏器/体重比值与对照组动物相比均无显著性差异。对肝、脾、肾、睾丸和卵巢等脏器进行病理检查也未发现显著的病理变化。对血液学检查结果和血清生化指标检查结果如表7和表8所示。与对照组比较，血清生化可见雄性动物低、高剂量组ALB显著降低，P<0.01和P<0.05；可见雄性动物低、中、高剂量组CREA显著降低，P<0.01；可见雌性动物低、高剂量组ALB显著降低，P<0.01和P<0.05；上述指标均在本单位正常值范围内，可认为不存在生物学意义。其他各项指标均与对照组没有明显不同。综上，该组方喂养30 d各项观察指标未见明显毒性作用。

表5 大鼠体重

表6 大鼠脏器/体重比值

3 讨论

L-精氨酸具有调节免疫、促进蛋白质合成、保护胃黏膜等多种独特的生理和药理功能，在临床营养治疗中发挥着重要作用[1-3]。山楂提取物、知母提取物、虾青素等天然抗氧化物剂，含有大量能清除过量自由基的抗氧化成分，具有辅助保护心血管、降血压、降血脂、降血糖以及抑制神经退行性疾病等功能[15-16]。

本组方由L-精氨酸和天然抗氧化物质(山楂提取物、知母提取物和虾青素)组成，本实验按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)对该组方的毒理学进行评价。研究结果显示，该组方对小鼠急性毒性试验中的MTD值>20.0 g/(kg·BW)，依据急性毒性分级标准，该组方属于无毒级。小鼠Aems试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验均未发现该组方样品有致突变作用。按人体推荐量的25、 50和100倍3个剂量，饲喂SD大鼠30 d，各组动物生长发育良好，体重、脏器重量、脏器系数、血液学检查结果和血清生化指标等均未见异常。

表7 大鼠血液学检查结果

表8 大鼠血清生化指标检查结果

综上，本实验结果表明该组方是安全的，为其进一步开发健康食品及药品提供了毒理学方面的科学依据。