1例产后哺乳期腹泻患者分离单增李斯特菌的生物学特征分析

张敬蕊，刘 力，王怡倩，杨如刚，许彩虹，刘菁菁，叶长芸

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)广泛存在于自然环境中，是一种重要的食源性感染致病菌，可导致人和动物李斯特菌病[1]。Lm感染类型主要分为两大类，一类为侵袭性感染，主要表现为败血症、脑膜炎及脑膜脑炎，死亡率较高；老幼、孕妇和免疫力低下的人群易感；围产期孕妇感染Lm主要表现为流产、早产、以及死胎，胎儿感染后可发生新生儿败血症和脑膜炎。第二类为非侵袭性感染，即免疫力正常的健康人群进食了被大量Lm污染的食品后出现发热性胃肠炎症状，这类感染多为自限性，容易被忽视[2]。国内腹泻病人粪便中检出Lm的报道很少，高波等[3]在410份腹泻病人粪便标本中分离到1株Lm。本研究从1例哺乳期患者粪便中分离到1株Lm，报道如下。

1 病 例

患者，28岁，哺乳期女性，婴儿6个月。发病经过：在进食一个甜瓜和饮用冰箱冷藏的酸奶1 d后，出现腹泻症状，最多时可达6～7次/ d。腹泻第2 d就诊于当地诊所，口服黄连素治疗，症状缓解，腹泻次数减少，腹泻2～3次/ d，大便仍为黏液状。于2018年5月10日就诊于我院内科，询问病人初期情况，考虑急性胃炎，患者无发热。实验室检查：血常规白细胞、中性粒细胞正常、C反应蛋白正常；便常规：黄色稀便，白细胞3～4个/HP，潜血阴性，轮状病毒和腺病毒检测阴性。2018年5月15日粪便培养结果为Lm阳性，因患者青霉素过敏，口服红霉素进行治疗。2018年5月23日，患者复查便常规(黄色软便，未见白细胞和红细胞，潜血阴性)、便培养(未检出Lm)。治疗后患者未再出现腹泻症状；在此期间婴儿无腹泻症状。

2 分离培养结果

参照《感染性腹泻诊断标准 WS271-2007》和《细菌性腹泻临床实验室诊断操作指南WS/T498-2017》[4]和相关文献[5]分离培养腹泻相关病原菌。

2.1志贺菌检测 挑取适量粪便标本分别加入接种于HE培养基和MAC培养基，36 ℃培养18 h，未检出志贺菌。

2.2沙门菌检测 挑取适量粪便接种于SBG增菌液，36 ℃培养18 h，转种于沙门菌显色平板和HE培养基，36 ℃培养18 h，未检出沙门菌。

2.3致泻性大肠杆菌和O157大肠杆菌检测 将标本接种于EMB、MAC和O157显色培养基，36 ℃培养18 h，未检出致泻性大肠杆菌和O157大肠杆菌。

2.4Lm检测 挑取适量粪便标本接种于LB1 增菌液中，放入30 ℃培养箱培养18 h，吸取LB1培养物1 mL 加入到 LB2 增菌液中， 30 ℃二次增菌培养18 h；取LB2 培养物转种于李斯特菌显色培养基(CHROMagar)，36 ℃培养18 h。显色培养基上出现蓝色、周围有透明晕环的菌落(图1)，接种于血平板后生长的菌落光滑湿润，灰白色，可产生窄小的β-溶血环(图2)。挑取可疑菌落进行革兰染色，采用细菌鉴定仪进行鉴定。

图1 李斯特菌显色培养基(CHROMagar)上生长菌落Fig.1 Colonies growing on Listeria chromogenic medium (CHROMagar)

图2 血平板上生长的疑似菌落Fig.2 Suspected colonies growing on blood plate

3 Lm的鉴定

对可疑菌落进行涂片染色，结果为革兰阳性杆菌。同时将可疑菌落穿刺于半固体培养管进行动力试验，30 ℃培养箱中24 h，观察实验结果为动力阳性，取菌落的纯培养物经VITEK- 2 COMPACT30 全自动细菌分析仪鉴定系统鉴定为Lm。实验采用ATCC19115菌株作为Lm质控菌株。

4 Lm血清型、PFGE分析、MLST分型和毒力基因检测

4.1使用日本Denka-Seiken公司的血清抗体，按照产品的说明书对分离到的Lm进行血清型检测，证实该分离株为4b血清型。

4.2参照法国巴斯德研究所Lm多位点序列分型(MLST)数据库的操作流程(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmoono. html)，采用PCR方法，对Lm 7个管家基因(abcZ，blgA，cat，dapE，dat，ldh，lhkA)的部分片段进行扩增、测序，将获得的基因序列与MLST数据库信息进行比对分析，证实分离的Lm菌株为ST145型，属于家系I的CC2克隆群。

4.3按照CDC PluseNet标准化操作方法，应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对Lm分析，采用AscI和ApaI对Lm进行酶切，菌株DNA电泳图像使用BioNumerisc软件分析，并与中国CDC病原菌识别网中的单增李斯特菌数据库进行比对，确定Lm分离株为GX6A16.CN0033型。

4.4参照相关文献[6-7]进行毒力基因检测，本研究病例分离的Lm携带毒力基因plcB、act、hly、iap、prfA、inlA。

5 药敏试验

按照2018年CLSI(美国临床和实验室标准协会)标准，应用温州康泰的E-test条，采用E-test方法对Lm分离株进行5种抗生素的药敏试验，结果证实其对青霉素、氨苄西林、美罗培南、红霉素和复方磺胺均敏感。

6 讨 论

Lm是一种重要的食源性病原菌，能引起人的侵袭性及非侵袭性感染[8]。Lm能产生溶血素，对人的致病性较强，可引起成人腹泻，尤其容易导致老年人、孕妇、新生儿和免疫缺陷患者感染发生李斯特菌病[9]。文献[10]报道健康成年人对Lm具有抵抗性，暴露后仅发生轻度胃肠炎，且具有自限性。Lm 可突破肠道黏膜屏障，进入肝细胞进行繁殖和扩增，并可通过血液系统在体内扩散，能被T淋巴细胞介导的免疫应答反应清除[11]。高波等[3]从410份腹泻病人便标本中分离到1株Lm，提示Lm可感染人群可引起不可自愈的腹泻症状。本例患者食用甜瓜和冰箱保存的酸奶后发生未能自愈的较严重的李斯特菌性腹泻，可能与感染的Lm菌量、菌株型别以及机体免疫力等有关，因此对于临床腹泻患者粪便标本的检测病原应该包括Lm，避免漏诊及不良预后。

我国北京通州、河北、福建以及黑龙江等多个地方在食品中Lm分离株主要为1/2a血清型[12]，不同血清型Lm菌株的致病力有所不同，98%以上人类李斯特菌病主要由1/2a、1/2b、1/2c和4b等血清型引起[13]。李秀娟等[14]报道石家庄地区李斯特菌食源性感染分离的Lm菌株血清型为1/2a型、2b型、1/2c型和4b型，其中1/2a型菌株数量最多。闫鹤等[15]分析河北省91株食源性致病李斯特菌证实主要血清型为1/2a型。大部分人类李斯特菌病由4b血清型Lm菌株引起，脑膜炎病人样本中4b型Lm菌株的分离率明显高于一般患者，而且4b血清型Lm感染者的死亡率(26%)显著高于1/2血清型(1/2a、1/2b和1/2c)菌株感染患者(16%)[16]。本例患者分离的菌株也为4b型，该型菌株在消化道中的耐受力是否更强以及和(或)比其他型别菌株进入宿主细胞的效率更高，有待于进一步研究证实。

Sylvain等[17]对来源于五大洲的300株单增李斯特菌进行基因型分析发现，家系Ⅰ中CC3克隆群是一个世界性分布的流行克隆群。本例患者分离的Lm为ST145型属于CC2克隆群，ST145型菌株最早在俄罗斯海参崴地区的啮齿动物和河流淤泥中分离出，且与ST2比较属于同一克隆复合群[18-19]。甘霖等[20]从云南滇池栖息的候鸟-红嘴鸥粪便中分离到ST145型Lm菌株，其基因组与本例病人分离的菌株具有高度的同源性，而我国此前尚未有关从食品、环境及病人分离到ST145型Lm的报道，因此由红嘴鸥等跨国迁徙的候鸟所导致的高致病性Lm传入我国对人群具有较高的感染风险。

王红等[2]报道四川省自贡市分离的3株Lm临床分离菌株为ST8型、ST778型；王艳等[21]对28例临床病人分离单增李斯特菌分析发现了1/2b血清型的ST87和ST3型菌株为病人感染的优势菌型；张晓嫒等[22]对北京市49例李斯特菌病人分离的Lm进行了分析，发现优势菌株为ST8、ST5、ST87型。提示石家庄地区食源性感染的Lm 存在和我国其他地区不同的ST型别。本例患者腹泻症状明显、持续时间长，是否与ST145型Lm特殊的致病性有关还需进一步研究证实。Lm的致病性与其毒力基因有密切相关性，缺失毒力基因将会导致其致病性消失或下降。本例患者分离的Lm 携带6种毒力基因，与2005-2011年(无2009年)石家庄市地区食品中分离Lm菌株一致[14]。

由于缺乏当地同期的食品及鸟类等来源菌株的相关信息，无法对本例患者感染的来源进行追溯。但作为我国首例ST145型菌株引起的感染病例报道，对于监测该型菌株在我国的分布状况、评价动物输入性李斯特菌病的感染风险分析及制定有效的防控措施具有重要意义。

李斯特菌病尚未纳入我国法定传染病的范畴，缺乏对于人群感染风险及临床李斯特菌病发病率的相关数据，已有报道以食源性单增李斯特菌分析为多。近年来各地报道的李斯特菌临床病例不断增加，而单增李斯特菌引起的腹泻患者容易漏诊，临床机构应加强孕妇等高危人群腹泻患者粪便标本中Lm的检测，这对于李斯特菌病病人的及时治疗和避免不良预后具有重要意义。

利益冲突：无

引用本文格式：张敬蕊，刘力，王怡倩，等.1例产后哺乳期腹泻患者分离单增李斯特菌的生物学特征分析[J].中国人兽共患病学报，2020，36(2)：169-172. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.021