眼用伊曲康唑固体脂质纳米粒的制备及其体外释放

王敬博，卢萍，梁珍，郭莹，张振，张俊杰

(河南省人民医院/河南省眼科研究所/河南大学人民医院，河南 郑州 450000)

近年来，固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)作为一种眼用药物载体引起了人们极大的兴趣，其在药物传递，特别是在药物释放控制和靶向特定组织方面具有巨大的应用潜力[1]。伊曲康唑(itraconazole，ITZ)是一种唑类抗真菌药物，临床上广泛用于治疗各种严重的真菌感染，包括曲霉病、隐球菌病、念珠菌病、囊胚菌病、播散性青霉病、荚膜组织浆菌病等[2]。ITZ通过抑制细胞色素P450氧化酶介导的麦角甾醇的合成而起作用[3]。目前市售的伊曲康唑主要是全身应用的剂型，包括胶囊剂、口服液和注射液，全身用药难以在角膜中取得有效的抗真菌药物浓度，且治疗真菌容易造成较严重的肝肾毒性。因此，本实验尝试制备局部滴眼液来达到治疗目的。

1 材料与方法

1.1 仪器Nano ZS-90型纳米粒度仪(英国马尔文公司)；2695型高效液相色谱分析(high performance liquid chromatography，HPLC)系统(美国Waters公司)；TS-100C恒温振荡器(匡贝实业有限公司，中国)；梅特勒AE260电子分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；ZNCL-BS磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；Eppendorf高速离心机(Abbott公司，德国)；Eppendorf 5810R低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)。

1.2 试剂伊曲康唑(上海化成工业发展有限公司)；Precirol ATO5(源叶生物)；甘油(南昌白云药业有限公司)；Kolliphor@HS 15(德国巴斯夫公司)；Capryol 90(源叶生物)；植物凝胶(大连美仑生物技术有限公司，批号J0212A)；二氯甲烷(美国Tedia公司)；吐温80、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲醇(美国Tedia公司，批号15065035，HPLC级)。

1.3 实验方法

1.3.1纳米粒的制备 采用微乳法及低温固化法，精密称取处方量的伊曲康唑原料药加入1 mL的二氯甲烷溶解，精密称取处方量的Capryol 90，Precirol ATO5，70 ℃水浴使其溶解，作为油相，将二氯甲烷溶解后的药物加入油相中，70 ℃水浴10 min使二氯甲烷完全挥发。另取处方量的Kolliphor@HS 15、甘油于油相中，70 ℃水浴使其混合均匀，加入约20 mL同温纯化水，持续搅拌5 min，然后加入20 mL质量分数为8 g·L-1的植物凝胶溶液，冰水浴中持续搅拌30 min，加水定容至50 mL，即得无色透明ITZ-SLN溶液，4 ℃冰箱保存。

1.3.2ITZ-SLN含量方法的建立 (1)色谱条件。色谱柱：Waters X-Bridge C18(150 mm×3.0 mm，3.5 μm)。流动相：V纯水∶V甲醇=20∶80。流速：0.4 mL·min-1。柱温：40 ℃。进样量：10 μL。检测波长：262 nm。(2)标准曲线的建立。取伊曲康唑对照品，精密称取5 mg，甲醇溶解，用甲醇定容至50 mL量瓶中，得伊曲康唑储备液100 μg·mL-1。精密量取伊曲康唑储备液0.8 mL，加入3.2 mL甲醇，配制成质量浓度为20 μg·mL-1对照品溶液，依次倍比稀释成10、5、2.5、1.25、0.625 μg·mL-1伊曲康唑对照品溶液，高效液相法测峰面积，以峰面积A对浓度C进行回归，得到标准曲线方程为：A=77 143C-2 405.4(R2=0.999 9，n=5)，表明伊曲康唑在0.625～10 μg·mL-1范围内与峰面积成良好线性关系。

1.3.3精密度 精密量取适量伊曲康唑储备液，用甲醇配制低、中、高(5、2.5、1.25 μg·mL-1)3个浓度的标准液，按“1.3.2”项下色谱条件，1 d内重复测定5次，计算日内精密度。同法取3种浓度的样品，连续测5 d，计算日间精密度。

1.3.4回收率试验 精密量取适量浓储备液，用甲醇配制成8、10、12 μg·mL-1(低、中、高)3种浓度的伊曲康唑溶液，加入适量(200 μL)空白脂质纳米粒，按“1.3.2”色谱条件进样，每种浓度平行操作3次，计算平均回收率。

1.3.5包封率和载药量 采用超滤离心法，精密量取ITZ-SLN 4 mL于超滤管套管(分子量为10 000)中，以4 000 r·min-1离心30 min，取滤液。按“1.3.2”项下色谱条件测面积，代入回归方程，计算游离药物浓度(Cfree)。精密量取ITZ-SLN 1 mL，加适量甲醇破乳，取破乳后溶液，用甲醇稀释一定倍数，按“1.3.2”项下色谱条件测面积，代入回归方程，计算总药物浓度(Ctotal)。包封率(EE%)及载药量(DL%)按下列公式计算：EE% =(Ctotal-Cfree)/Ctotal×100%；DL%=(Ctotal-Cfree)/M×100%。式中Ctotal为纳米粒中总药物浓度，Cfree为游离药物含量，M为纳米粒中脂质的质量。

1.3.6粒径与电位 取适量样品稀释后，采用马尔文激光粒度仪(英国马尔文公司)测定纳米粒的Zeta电位与粒度分布。

1.4 体外释放的考察

1.4.1介质的选择 在人工泪液中加入20 g·L-1吐温-80，制成20 g·L-1吐温80-AFT溶液混合液，精密量取20 mL该混合液于玻璃瓶中，精密称量0.020 0 g 伊曲康唑原料药于该玻璃瓶中，恒温震荡过夜，取2 mL样品4 000 r·min-1离心，取上清，HPLC法测浓度，计算溶解度约为12.51 μg·mL-1，可满足漏槽条件。在人工泪液中加入20 g·L-1的SDS制成20 g·L-1的SDS-AFT溶液，精密量取20 mL于玻璃瓶中，精密称量0.020 0 g伊曲康唑原料药于该玻璃瓶中，恒温震荡过夜，取2 mL样品4 000 r·min-1离心，取上清，稀释10倍后HPLC法测浓度，计算溶解度约为80 μg·mL-1，可满足漏槽条件。上述两种介质可供选择。

1.4.2方法的选择 (1)动态透析法。取2 mL ITZ-SLN于透析袋中，透析袋放入玻璃释放瓶中加入150 mL含有20 g·L-1吐温80-AFT的混合液，将玻璃释放瓶放入恒温振荡器中，37 ℃轻微震荡。分别于不同时间点(0、30、60、120、360、720、1 440 min)从释放瓶中取出释放液2 mL，同时补充新鲜介质2 mL，用HPLC-UV检测其含量。(2)新动态透析法。取2 mL ITZ-SLN于透析袋中，透析袋放入玻璃释放瓶中，加入150 mL含有20 g·L-1吐温80-AFT的混合液，将玻璃释放瓶放入恒温振荡器中，37 ℃轻微震荡。分别于不同时间点(0、30、60、120、360、720、1 440 min)从释放瓶中取出释放液2 mL，同时将介质倒掉，换上新鲜介质150 mL，用HPLC-UV检测其含量。(3)直接扩散法[4-6]。精密量取20 μL ITZ-SLN于1 mL EP管中，加入480 μL人工泪液，放入恒温震荡器中，37 ℃轻微震荡。分别于不同时间点(30、60、120、360、720、1 440 min)取出对应的EP管，3 000 r·min-1离心5 min，取沉淀，加500 μL甲醇溶解，用HPLC-UV检测沉淀中药物的含量。(4)扩散-超滤离心法[7]。取新鲜配制的质量浓度为20 g·L-1的SDS-ATF 50 mL作为释放液置于30 mL的玻璃释放瓶中。取2 mL质量浓度为1 g·L-1的ITZ-SLN制剂处方于上述玻璃释放瓶中，每个处方平行制备3份，置于TS-100C恒温振荡器中，37 ℃，120 r·min-1恒温振荡，分别于30、60、120、360、720、1 440 min后从释放瓶内取出释放液2 mL，加入分子量为10 000的超滤管中，4 000 r·min-1离心5 min，取滤液，用HPLC-UV检测，同时在释放瓶中补加37 ℃等体积的空白释放液，每组平行做3份，采用“1.3.2”项下的色谱条件测面积。

2 结果

2.1 精密度日内精密度RSD分别为0.56%、0.48%、0.74%(n=5)，日间精密度RSD分别为0.60%、1.47%、0.68%(n=5)，证明方法准确度良好，符合方法学要求。

2.2 回收率3种质量浓度的回收率分别为(99.47±0.71)%、(98.53±0.77)%、(99.57±0.94)%，RSD分别为0.88%、0.96%、1.16%，RSD均小于2%，符合药典要求。

2.3 包封率和载药量按“1.3.1”制备工艺同时制备5份ITZ-SLN测得包封率及载药量分别为(96.02±2.10)%、(0.15±0.02)%。

2.4 粒径与电位其粒径与电位分别为(15.23±2.10)nm、(-22.65±0.91)mV。

2.5 体外释放4种检测体外释放的方法中，只有扩散-超滤离心法可检测到释放药物含量，ITZ-SLN在30、60、120、360、720、1 440 min分别释放了8.04%、17.70%、29.9%、60.70%、65.30%、71.78%。计算各个时间点累计释放量，并对时间作图，释放曲线见图1。

图1 伊曲康唑固体脂质纳米粒(ITZ-SLN)

体外释放拟合方程：对上述体外释放曲线使用Origin Pro 8.0软件进行动力学模型拟合[8-10]，如零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi方程，详见表1。

表1 不同方程拟合伊曲康唑固体脂质纳米粒(ITZ-SLN)的 体外释放度(n=3)

通过比较不同公式的零级、一级、Higuchi模型的相关系数(R2)，发现该释放的最佳拟合模型为一级动力学方程。

3 讨论

SLN是一种新型胶体给药系统[11]，具有良好的生理相容性，且具有缓释、控释的特性，可提高药物的生物利用度，适用于包裹亲脂性药物[12]，其作为眼部给药的载体，安全性高。而伊曲康唑为极难溶于水的脂溶性药物，因此ITZ-SLN是一种理想制剂。目前SLN的制备工艺方法主要有微乳法、高压匀质法、溶剂扩散法、低温固化法和薄膜超声分散法[13]。与其他需要额外能量输入的技术相比，微乳法简单，省时，易于应用[14]，且具有实验条件温和，易于得到较小粒径(10～100 nm)纳米粒的优点。因伊曲康唑在Precirol ATO5[15]、Capryol 90[16]中溶解度较高，所以本实验将选择这两种脂质作为油相，采用微乳法及低温固化法制备的3批ITZ-SLN，其粒径约为15.23 nm，分布均匀，表明制备工艺稳定。Zeta电位约为-22.65 mV，带有负电荷，属于热力学稳定体系。其含量测定采用反HPLC法，具有快速、灵敏、准确等优点，测得该处方的包封率为(96.02±2.10)%，较高，但是载药量仅为(0.15±0.02)%，所以需要进一步优化，以得到较高载药量的处方。

体外释放的考察，本实验采用混合介质作为释放介质，因为伊曲康唑极难溶于水，常规的人工泪液作为释放介质很难满足漏槽条件。采用透析法考察伊曲康唑固体脂质纳米的体外释放，并未检测到药物释放含量，考虑其原因可能为介质中吐温-80和SDS的含量超过了临界胶束，使其形成了胶束溶液，而胶束难以从透析袋中释放出来。采用直接扩散法未检测到药物含量的可能原因有待于进一步探讨。扩散-超滤离心法未经过透析袋，药物缓慢释放后在释放液中形成新的胶束溶液，经超滤管过滤掉未释放的药物，检测滤液中的药物含量即为所释放的含量，此方法可适用于难溶性药物。体外释放试验表明，在最初的3 h内，药物释放较快，而接下来的24 h，药物释放相对较缓慢，这种缓释作用可以在眼部维持药物的治疗浓度。本实验尝试采用此工艺制备的ITZ-SLN达到了预期的缓释目的。其后续的离体角膜渗透及药物代谢动力学仍需进一步研究。