幽门螺旋杆菌相关胃病不同中医证候患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1的表达及临床意义*

张灵利，何艳杰，李 红

1.辽宁省朝阳市中心医院（朝阳120000）；2.辽宁中医药大学附属医院消化内科（沈阳110032）

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，HP）被世界卫生组织列为一类致癌病原体［1］。在祖国传统医学中，认为HP是一种“邪气”，侵入机体后会导致机体出现脾胃湿热、肝胃不和等中医证候，而中医证候可动态反应疾病微观变化［2］。HP 属于“痞满”、“胃脘痛”范畴，病因多为饮食不节，病机为脾胃升降失调、血瘀气阻等，而血淤气阻、郁热等病理变化可促进HP 附着、繁殖，为疾病发生提供客观条件。基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）属于MMPs家族，具有降解细胞外基质作用，参与炎症反应及肿瘤发生，同时具有修复、重塑细胞膜及细胞外基质作用［3］。基质金属蛋白酶抑制物-1（Tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1）是MMPs抑制剂，对MMP-2表达水平及活性起到抑制作用［4］。本研究旨在通过观察HP相关胃病不同中医证候患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1的表达情况，初步分析两者表达临床意义，为不同中医证候发病机制提供一定参考价值。

资料和方法

1 一般资料 选取本院2018年10月至2019年10月期间收治的HP 相关胃病患者58 例为研究对象，根据中医证候不同分为脾胃湿热证组、脾胃不和证组和肝胃不和证组。脾胃湿热证组23 例，其中男性10例，女性13例；年龄29～58岁，平均年龄（42.08±8.64）岁；胃炎17例，胃溃疡5例；病程4～31年，平均（17.53±6.75）年。脾胃不和证组18例，其中男性8例，女性10 例；年龄30～60 岁，平均年龄（42.78±8.70）岁；胃炎14例，胃溃疡4例；病程3～32年，平均（17.61±6.88）年。肝胃不和证组17例，其中男性7例，女性10 例；年龄28～60 岁，平均年龄（42.51±8.76）岁；胃炎14例，胃溃疡3例；病程4～33年，平均（17.72±6.94）年。各疾病组性别、年龄、病种及病程比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。另选取同期来本院体检的健康志愿者20例作为对照组，其中男性8例，女性12例；年龄27～60岁，平均年龄（41.72±7.13）岁。对照组与各疾病组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准同意。病例纳入标准：符合《中国慢性胃炎共识意见》［5］中慢性胃炎相关诊断标准或符合消化性溃疡相关诊断标准［6］；年龄范围在18～60岁之间；中医辨证诊断为脾胃湿热证、脾胃不和证或肝胃不和证；所有患者对本研究充分知情，并自愿签署病人知情同意书。排除标准：合并严重心脑血管系统、肝肾系统等内科疾病者；年龄超出18～60岁范围者；近期接受抗生素、抑酸药、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂、非甾体类抗炎药等相关治疗；妊娠期和哺乳期女性；具有心理疾病史、精神疾病史者；依从性较差，不配合研究者。

2 研究方法

2.1 胃黏膜标本获取：所有受试者均采用GIFXQ260型电子胃镜进行检查，并钳取胃大弯、胃小弯侧（胃窦距幽门约2 cm 处）2块胃黏膜组织，面积约为0.1 cm2，分别进行HP快速尿素酶检测和美篮染色法检测。HP感染检测，即快速尿素酶检测：取出胃黏膜组织块后，迅速将其放入检测试剂中，观察试剂颜色变化，若试剂由黄色变为红色，提示为HP 阳性，若试剂颜色不变，提示为HP 阴性。快速尿素酶检测试剂盒购自上海抚生实业有限公司。美蓝染色法检测：取出胃黏膜组织块后，将其浸于4%多聚甲醛中进行固定，常规脱水后进行石蜡包埋，并切片，切片厚度约为4 μm。切片常规脱蜡至水，滴加1%美蓝溶液，染色5～10 min，采用自来水将染料清洗干净，常规脱水、二甲苯透明，自后采用中性树胶封片，在镜下观察染色情况，若观察到蓝色弯曲杆菌，提示为HP阳性。本研究快速尿素酶检测和美蓝染色法检测均提示HP阳性者视作HP阳性，否则为HP阴性。

2.2 胃黏膜炎症状态检测：采用HE染色法观察胃黏膜炎症状态。具体步骤如下：获取的胃黏膜组织块浸于4%的多聚甲醛中进行固定，然后常规脱水、透明石蜡包埋，并切片，二甲苯及梯度酒精脱蜡至水，苏木素溶液染色15 min 左右，盐酸乙醇分化30 s，伊红溶液染色1～2 min，采用自来水将染料清洗干净，再经常规脱水、透明后，采用中性树胶封片，在镜下观察胃黏膜炎症状态。胃黏膜炎症程度分为轻度、中度及重度，每个切片均由2名病理科医师独立进行诊断，当诊断结果不一致时，共同探讨得出最终诊断结果。

2.3 胃黏膜MMP-2、TIMP-1表达水平检测：采用免疫组化SP 法检测胃黏膜MMP-2、TIMP-1表达水平。具体步骤如下：同HE染色制作切片，常规脱蜡至水，采用3%H2O2处理10 min使内源性过氧化物酶失活，冲洗3次后，采用置于0.01 M 枸橼酸缓冲液中加热（95℃）处理20 min进行抗原修复，待冷却，采用羊血清工作液于室温下进行封闭，滴加一抗，4℃孵育12 h，冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1 h，冲洗3次，滴加链霉亲和素-过氧化物酶，室温下孵育1 h。DAB 显色5-8 min，自来水充分冲洗以终止反应，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片，在镜下观察染色情况，并采用图像分析系统分析胃黏膜组织中MMP-2、TIMP-1 表达水平，以染色指数表示。鼠抗人MMP-2一抗和鼠抗人TIMP-1一抗均购自厦门研科生物技术有限公司。免疫组化试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司。

3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行统计学推断。计量数据服从正态分布，且方差齐，用平均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。计数数据百分率（%）表示，多组比较采用卡方检验，多组间两两比较采用卡方分割法比较。等级数据用例数表示，多组间比较采用秩和检验，多组间两两比较采用Nemenyi检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05，均为双侧检验。

结 果

1 不同中医证型患者HP检出情况 不同中医证型患者HP 感染率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 不同中医证型患者HP检出情况

2 不同中医证型患者胃黏膜炎症反应程度 各组间胃黏膜炎症反应程度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与对照组相比，脾胃湿热证组、脾胃不和证组和肝胃不和证组胃黏膜炎症反应程度均较为严重，差异有统计学意义（P＜0.05），与肝胃不和证组相比，脾胃湿热证组、脾胃不和证组胃黏膜炎症反应程度均较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 不同中医证型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表达情况 各组间胃黏膜MMP-2表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），各组间胃黏膜TIMP-1表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），脾胃湿热证组、脾胃不和证组和肝胃不和证组胃黏膜TIMP-1表达水平均高于对照组，脾胃不和证组和肝胃不和证组胃黏膜TIMP-1表达水平均高于脾胃湿热证组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表2 不同中医证型患者胃黏膜炎症反应程度（n）

表3 不同中医证型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表达情况

表3 不同中医证型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表达情况

注：与对照组比较，*P＜0.05；与脾胃湿热证组比较，＃P＜0.05

组 别 n MMP-2 TIMP-1脾胃湿热证组 23 1.93±0.56 1.62±0.51*脾胃不和证组 18 1.96±0.60 1.86±0.57*＃肝胃不和证组 17 1.94±0.58 1.82±0.55*＃对照组20 1.77±0.41 1.24±0.32

4 胃黏膜MMP-2、TIMP-1表达与HP 感染、胃黏膜炎症反应程度关系分析 MMP-2 表达水平与HP感染无明显相关性（r=-0.085，P＞0.05），与胃黏膜炎症反应程度呈负相关（r=-0.201，P＜0.05）。TIMP-1表达水平与HP 感染呈正相关（r=0.182，P＜0.05），与胃黏膜炎症反应程度呈正相关（r=0.268，P＜0.05）。

讨 论

临床常采用三联疗法或四联疗法对HP感染进行根治，但存在毒副作用大、易产生耐药性、复发率较高等缺点，所以临床医师逐渐将研究重点转向中医辨证治疗患有HP相关性胃病的患者［7-9］。

《胃脾论》中指出脾胃衰而百病生，《内经》中指出正气存内、邪不可干，以上提示中医理论体系的重要组成部分为脾胃学说，脾胃损伤为内在病因，邪气等为外在病因，当机体正气不足时，易导致邪气入侵，从而引发疾病。HP相关性胃病在中医学中属于“痞满”、“胃脘痛”范畴，病机主要是脾胃升降失调、气机阻滞，本质为本虚标实，本虚指的脾虚，标实指的本虚基础上形成的一系列病理变化（如血瘀、气滞、湿阻等）［10］。HP在中医学中将其归属于“邪气”，可引起许多胃部疾病发生。人类体质有9种基本类型，即气虚质、气郁质、阳虚质、阴虚质、平和质、湿热质、癖血质、痰湿质和特禀质。脾胃湿热证主要表现为湿热质，脾胃不和证、肝胃不和证主要表现为气郁质［11］。有研究显示，且HP感染与HP相关性胃病中医证型存在一定关系，HP 相关性胃病中脾胃湿热证为主要中医证候型［12］。本研究结果显示，脾胃湿热证组HP 感染率高于脾胃不和证组、肝胃不和证组，但无明显差异，可能与本研究纳入病例数较少有关。

HP侵入机体后会损伤胃黏膜，引起不同程度炎症反应，本研究结果显示，不同证型组炎症反应程度均强于对照组，且疾病组中肝胃不和证组炎症反应程度最强，提示HP感染相关性胃疾病患者均表现出不同程度炎症损伤，其中肝胃不和证患者表现最为明显。分析原因，肝胃不和证患者情绪控制不佳，易动怒，从而导致气机不畅，中焦气机运行异常，肝气犯胃，所以该类患者胃黏膜炎症反应相对于脾胃湿热证和脾胃不和证患者更为严重。

MMPs能将细胞外基质降解，TIMPs则可抑制MMPs活性，两者相互制约，共同维持细胞外基质分泌与降解平衡［13-14］。MMPs和TIMPs在肿瘤发生发展中的研究较多，MMP-2作为MMPs的重要成员之一，活化后能破坏细胞基底膜，促进肿瘤细胞浸润及转移，而TIMP-1 可将此过程抑制。但关于MMP-2 和TIMP-1在HP相关胃部疾病中表达水平的研究相对较少。MMP-2不仅与肿瘤发生有关，在生理生长及病理损伤过程中还扮演者塑性和修复角色。苏玲玲等［15］研究观察到MMPs表达于腺体、固有膜及上皮细胞中，且胃部炎症反应越严重，迁移至上皮细胞的MMPs表达水平越高，认为MMPs可能通过类似细胞迁移的作用对胃黏膜起到保护作用。TIMP-1 作为MMP-2的内源性抑制剂，当炎症反应加剧时，TIMP-1水平明显升高。生理状态下，当胃部出现病理损伤时，MMP-2表达水平应明显上调以发挥修复作用，TIMP-1蛋白则应相对表达水平较低，MMP-2／TIMP-1平衡向MMP-2偏移，从而改善胃黏膜损伤状态。但本研究结果显示，疾病组MMP-2表达水平有所升高，但无明显差异，TIMP-1表达水平则明显升高，提示MMP-2／TIMP-1平衡向TIMP-1偏移，从而促进HP 相关性胃病胃黏膜损伤加重，疾病进一步发展。为了进一步明确检测MMP-2 和TIMP-2 表达的临床意义，本研究经相关性分析，发现MMP-2与胃黏膜炎症反应程度呈负相关，TIMP-1 与胃黏膜炎症反应程度呈正相关，提示MMP-2水平越低、TIMP-1水平越高，胃黏膜炎症反应越严重。

综上所述，HP 相关胃病患者存在 MMP-2／TIMP-1失衡现象，MMP-2 具有胃黏膜保护作用，TIMP-2可抑制MMP-2活性，与HP感染及胃黏膜炎症程度呈正相关，前者类似于中医学中的“正气”，后者类似于中医学中的“邪气”。而不同中医证候MMP-2、TIMP-1表达水平略有差异，可能与不同中医证候发病机制不同有关，本研究还需进一步扩大病例数进行研究。