丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区新生微血管的影响研究

郭荷娜，康蓓，赵婧钰，杨谦

卒中是全球范围内第二大致死性疾病，而我国卒中发病率及病死率全球最高，虽然1990—2016 年我国卒中致死率及致残率均有所下降，但其给患者家庭及社会带来的负担仍然很重［1］。再灌注治疗是目前临床治疗早期缺血性卒中的有效手段，但该治疗方法常受到溶栓治疗时间窗、技术设备等因素影响，获益人群十分有限。脑侧支循环指脑血管狭窄或闭塞后出现的一种代偿血管，是机体的一种代偿性表现［2］。因此，促进脑侧支循环开放、新生血管形成已成为治疗缺血性卒中的重要治疗思路。丹红注射液是从丹参和红花中提取的含有丹参素、丹参酚A 等成分的中药注射液，具有抗炎、抗氧化及保护神经等作用，目前已广泛用于治疗缺血性脑血管疾病［3］，但其具体作用机制尚未完全明确。本研究旨在探讨丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区新生微血管的影响，为进一步探究丹红注射液治疗缺血性卒中的具体作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 2018 年12 月—2019 年6 月，选取雄性SD 大鼠84 只，体质量180～220 g，均由西安交通大学动物实验中心提供。饲养环境：室温恒定为24 ℃，相对湿度为40%～60%，12 h 光照/黑暗交替进行，自由摄食及饮水，饲养笼、敷料及水瓶每3 d 更换1 次，且需要更换的物品均进行消毒处理。将84 只SD大鼠随机分为假手术组（n=12）、模型组（n=36）及丹红组（n=36）。

1.2 主要试剂及仪器 丹红注射液购自山东丹红制药有限公司（生产批号：18101015），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）购自Sigma 公司，鼠CD31 单克隆抗体、山羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德生物工程有限公司购自武汉博士德生物工程有限公司，苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，二氨基联苯胺（DAB）显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；OLYMPUS 光学显微镜，载玻片、盖玻片购自江苏世泰实验器材有限公司。

1.3 实验方法 参照改良LONGA 线栓法［4］制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型，具体如下：采用10%水合氯醛0.35 ml/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉满意后将大鼠固定于手术操作台，消毒并于颈部正中做一纵行切口，分离、暴露颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，之后于左侧颈总动脉分叉处近心端0.3 cm 处剪一斜形切口，沿颈内方向缓慢插入线栓，松开颈内动脉夹，当线栓头端距切口1.8～2.0 cm 且略感阻力后停止插线栓，2 h 后拔出线栓并恢复血流，逐层缝合皮肤。以造模后大鼠清醒时神经行为学评分1～3 分为造模成功，造模失败大鼠予以排除。造模组和丹红组大鼠制备脑缺血再灌注损伤模型；假手术组大鼠不插线栓，其他步骤同造模组。丹红组大鼠于拔出线栓后腹腔注射丹红注射液0.5 ml/kg，1次/d；造模组和假手术组均于相同时间点腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.4 观察指标

1.4.1 神经行为学评分 分别于造模后24 h、72 h、7 d评估三组大鼠神经行为学评分，神经行为学评分标准：0 分：无明显神经行为障碍；1 分：提尾悬空时右侧前肢体屈曲、不能前伸或左侧眼裂变小；2 分：置于光滑地面后向对侧转圈；3 分：站立不稳并向对侧倾斜；4 分：软瘫不能自发行走［5］。

1.4.2 脑梗死体积 造模后24 h、72 h、7 d 分别从假手术组选取2 只大鼠、造模组选取6 只大鼠、丹红组选取6 只大鼠并处死，取脑组织并置于-20 ℃冰箱中约15 min；在视交叉处冠状位切脑片5 张，每片厚约2 mm，剔除嗅球、后脑及其他组织；将切好的脑片置于2% TTC 溶液中，37 ℃恒温保存20～30 min，每6～7 min 翻动脑片，并使用相机拍照存储。脑梗死体积=患侧脑梗死体积/正常侧脑体积×100%。

1.4.3 脑组织病理学改变 采用HE 染色法观察脑组织病理学改变，具体如下：造模后24 h、72 h、7 d 分别从假手术组选取2 只大鼠、造模组选取6 只大鼠、丹红组选取6 只大鼠，麻醉满意后打开胸腔，于心脏左心室穿针并剪开右心耳，灌注37 ℃、0.9%氯化钠溶液100 ml至右心耳流出液变清亮，采用4%多基甲醛固定，大鼠剧烈抽动且后肢绷直即灌注成功，取全脑组织并置于4%多聚甲醛固定24 h。将脑组织制成1 cm×1 cm×0.2 cm大小后装入脱水包埋盒，采用乙醇梯度脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋，切片机切片，采用HE 染色，光镜下观察大鼠皮质区脑组织病理学改变。

1.4.4 新生微血管数目 采用免疫组化染色法观察缺血再灌注皮质区新生微血管数目，具体如下：将脑组织切片常规脱蜡至水，0.01 mol/L 枸橼酸钠缓冲液高温、高压抗原修复15 min；滴加一抗鼠CD31 单克隆抗体，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗2 min×3 次，加山羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃ 孵育30 min，PBS 漂洗2 min×3 次；DAB 显色，中性树胶封片，光学显微镜下观察并计数新生微血管，光镜下找出缺血再灌注皮质区3 个血管密度最高区域，以CD31 标记的棕黄色微血管为新生微血管，随机观察5 个视野并计算平均数。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 统计学软件进行数据处理，计量资料以（± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；两组间比较采用两独立样本t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经行为学评分 造模组和丹红组大鼠均造模成功。假手术组大鼠造模后24 h、72 h 及7 d 神经行为学评分均为0。造模组和丹红组大鼠造模后24、72 h 神经行为学评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；丹红组大鼠造模后7 d 神经行为学评分低于造模组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 造模组和丹红组大鼠造模后不同时间点神经行为学评分比较（±s，分）Table 1 Comparison of neurobehavioral score between model group and Danhong group at different time points after modeling

表1 造模组和丹红组大鼠造模后不同时间点神经行为学评分比较（±s，分）Table 1 Comparison of neurobehavioral score between model group and Danhong group at different time points after modeling

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2.2 脑梗死体积 假手术组大鼠造模后24 h、72 h 及7 d脑梗死体积均为0。丹红组大鼠造模后24 h、72 h 及7 d脑梗死体积小于造模组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2、图1）。

表2 造模组和丹红组大鼠造模后不同时间点脑梗死体积比较（± s，%）Table 2 Comparison of volume of cerebral infarction between model group and Danhong group at different time points after modeling

表2 造模组和丹红组大鼠造模后不同时间点脑梗死体积比较（± s，%）Table 2 Comparison of volume of cerebral infarction between model group and Danhong group at different time points after modeling

组别 只数 造模后24 h 造模后72 h 造模后7 d造模组 6 38.53±0.97 35.35±0.67 31.45±1.12丹红组 6 37.14±1.08 32.69±2.33 29.43±1.67 t 值 3.314 3.829 3.480 P 值 0.003 ＜0.01 0.002

2.3 脑组织病理学改变 假手术组大鼠皮质区神经元结构完整，轮廓清，排列整齐，核居于中央，胞质淡蓝色，无明显病理学改变；造模组大鼠皮质神经元排列紊乱，有间质性水肿及神经元变性、坏死；丹红组大鼠皮质区存在间质性水肿及神经元变性、坏死，但数量较造模组减少，见图2～3。

2.4 新生微血管数目 三组大鼠造模后24 h、72 h 及7 d脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模组和丹红组大鼠造模后24 h脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目多于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模组和丹红组大鼠造模后72 h 及7 d 脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目多于假手术组，丹红组大鼠脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目多于造模组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

3 讨论

脑缺血可引起脑组织氧化应激及炎性反应过度激活、神经元凋亡，而溶栓治疗或血管自动再通可使脑组织发生再灌注，但再灌注过程可能会加重脑组织损伤［6］。研究表明，建立有效的脑侧支循环可改善缺血性卒中患者预后，其原因主要与脑侧支循环可延缓永久性神经损伤、减少神经损伤及缩小梗死范围有关［7-8］。目前，脑侧支循环根据开放层次大致分为三级，其中一级侧支循环主要由willis 环的血管构成，二级侧支循环指眼动脉、软脑膜及其他相对较小的侧支与侧支吻合支，三级侧支循环指通过血管发生和血管生成等方式产生的新生供血血管，当一级、二级侧支循环不能满足供血需求时，新生血管形成就成为最终的侧支代偿途径［9］。

图1 三组大鼠造模后不同时间点脑片TTC 染色结果Figure 1 TTC staining results of brain slices in the three groups at different time points after modeling

图2 三组大鼠造模后7 d 脑组织病理学检查结果（HE 染色，×400）Figure 2 Pathological examination results of brain tissue in the three groups 7 days after modeling

图3 三组大鼠造模后72 h 脑缺血再灌注皮质区新生微血管情况（免疫组化染色，×400）Figure 3 Neovascularization in cortex with cerebral ischemia-reperfusion in the three groups 7 days after modeling

表3 三组大鼠造模后不同时间点脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目比较（±s，条）Table 3 Comparison of number of neovascularization in cortex with cerebral ischemia-reperfusion in the three groups at different time points after modeling

表3 三组大鼠造模后不同时间点脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目比较（±s，条）Table 3 Comparison of number of neovascularization in cortex with cerebral ischemia-reperfusion in the three groups at different time points after modeling

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与造模组比较，bP＜0.05

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丹红注射液主要有效成分为丹参、红花提取物，具有活血化瘀、通脉舒络等功效。本研究结果显示，造模组和丹红组大鼠造模后24、72 h 神经行为学评分间无统计学差异，但丹红组大鼠造模后7 d 神经行为学评分低于造模组，提示丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用较缓慢。本研究结果还显示，丹红组大鼠造模后24 h、72 h 及7 d 脑梗死体积小于造模组，提示丹红注射液能有效缩小脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积。

CD31是分子量为130 kD的细胞膜表面单链糖蛋白，属于免疫蛋白超家族成员，主要表达于血管内皮，在相邻内皮细胞及经内皮间迁移、介导同型白细胞黏附方面具有重要作用［10-11］。目前，由CD31 标记的新生微血管密度是公认的评价新生血管形成的标准［12］。因此，本研究通过观察CD31 表达情况而分析脑缺血再灌注损伤大鼠脑血管新生及侧支循环代偿情况，结果显示，造模组和丹红组大鼠造模后24 h 脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目多于假手术组；造模组和丹红组大鼠造模后72 h 及7 d 脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目多于假手术组，丹红组大鼠脑缺血再灌注皮质区新生微血管数目多于造模组，提示丹红注射液能有效增加脑缺血再灌注损伤大鼠梗死区新生微血管数目。既往研究表明，丹红注射液可通过上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达而促进缺血心肌、糖尿病足小鼠缺血肢体血管再生及斑马鱼节间血管再生［13-14］。VEGF 除与缺血区域微血管密度及新生血管数量有关外，还与神经保护、抗细胞凋亡、促进神经元再生关系密切［15-16］。因此，笔者所在课题组推测丹红注射液可能通过某种信号通路上调脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区VEGF 的表达而促进血管新生，进而保护神经功能、缩小脑梗死面积，下一步将从分子学水平探讨丹红注射液治疗缺血性卒中的具体作用机制。

综上所述，丹红注射液可有效增加脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区新生微血管数量，改善脑侧支循环，进而减轻神经功能缺损、缩小脑梗死体积。

作者贡献：郭荷娜进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，对文章整体负责，监督管理；赵婧钰进行数据收集、整理、分析，负责撰写论文；郭荷娜、赵婧钰进行结果分析与解释；康蓓进行论文的修订；杨谦负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。