基于网络药理学方法探讨八珍汤治疗ITP的作用机制＊

姜云耀，刘 楠，胡晓梅，侯金才，刘建勋＊＊

（1. 清华大学药学院中药研究院 北京 100084；2. 北京盈科瑞药物安全有效性研究有限公司 北京 102206；3. 中国中医科学院西苑医院 北京 100091；4. 京津冀联创药物研究（北京）有限公司 北京 100083）

原发免疫性血小板减少症（Primary immune thrombocytopenia，ITP）以前又被称为“特发性血小板减少性紫癜”。导致血小板减少的原因有很多，机体对自身血小板抗原免疫失耐受是主要原因之一，也是ITP 发生的主要原因。骨髓巨核细胞成熟障碍是ITP发生的最常见表现，临床上也多表现出皮肤、黏膜、内脏出血等症状，严重时可以直接危及到生命。目前，西方医学尚未发现十分有效的ITP 治疗方法，现有方法十分局限，且伴有较大的副作用。中医药治疗ITP具有独特优势，因此应当加快相关研究进展。中药八珍汤由人参、当归、茯苓、甘草、川芎、白术、熟地黄、白芍8味药材组成，具有益气补血的功效，主治气血两虚证，在临床上主要用于气不摄血型ITP 的治疗。金小洣[1]发现以益气补血、养阴生精、凉血止血为法治疗ITP 疗效显著，并用加味八珍汤治愈ITP，愈后随访未见复发。文鸿光等[2]以加味八珍汤联合小剂量醋酸泼尼松片的方法治疗ITP，明显提高了患者血小板计数，显著提高了临床疗效，并改善患者的生活质量。熊春琦[3]用八珍汤加味联合激素成功治愈了36 例ITP 患者。八珍汤既有补气又有补血的功效，研究表明八珍汤治疗ITP 与抑制血小板聚集、增强机体造血功能和调节免疫功能等密切相关。但目前尚未有八珍汤治疗ITP作用机制的相关报道。

中药方剂在中国具有数千年的应用历史，是中医整体观的体现，具有配伍的特点。随着近年来对中药方剂研究的不断深入，其复杂的化学体系与机体复杂生物系统的相互作用成为当前研究的重要课题[4]。生物网络及多靶点的干预方法符合中药方剂的作用特点，运用网络与系统的思想有助于对方剂复杂的化学体系和作用机制进行理解。因此，从生物网络调控的角度揭示中药方剂的作用奥秘，既符合中药作用的整体理论，又符合中医药现代化研究的研究思路[5]。为了从系统角度和分子水平阐明中药，研究者建立了“网络靶标，多成分”模式的中药网络药理学方法，预测中药的靶点和药理作用，解释中药方剂的配伍规则和网络调节作用[6]。

本研究运用网络药理学的方法从分子水平上阐述八珍汤化学成分与成分之间、成分与靶点之间、靶点与疾病之间的潜在联系，探索成分、靶点、蛋白质和疾病之间的相互作用关系[7]，从而探讨八珍汤治疗ITP的作用机制，为进一步明确ITP 的发生机制及八珍汤治疗ITP的相关机理提供理论基础。

1 材料

中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[8]；Drugbank 数据库（https://www.drugbank.ca/）[9]；Cytoscape 3.7.1 软 件[10]；OMIM 数据库（Online Mendelian Inheritance in Man）；TTD 数据库（Therapeutic Targets Database）[11]；GAD 数 据 库（Genetic Association Database）；GeneCards 数据库[12]；STRING 数据库 ；DAVID 数据库（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）[13]；KEGG 数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[14]；Omicshare。

2 方法

2.1 八珍汤化学成分筛选和靶点预测

中药八珍汤由人参、熟地黄、当归、甘草、川芎、白术、白芍、茯苓8 味药组成。参照刘楠等[15]的方法，通过TCMSP 数据库和国内外文献研究收集上述8 味中药的主要化学成分，同时设定口服生物利用度（OB）和类药性（DL）等相关参数对收集到的八珍汤的主要化学成分进行筛选。根据文献报道，参数设定条件为OB ≥30%和DL ≥0.18[16]，筛选符合条件的化学成分，既而选取来源于Drugbank 数据库的化学成分作用靶点信息，同时剔除非人源靶点。一些化合物如益母草苷、梓醇、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯I等虽然不满足筛选条件，但是通过查阅文献可知这些化合物在治疗ITP 方面具有相关活性，所以将这些不满足筛选条件的化合物也一并作为候选成分纳入分析[17]。在设定OB、DL 作为筛选条件的基础上又通过文献查找的方式收集八珍汤化学成分，使得结果更全面。

2.2 ITP相关靶点获取

ITP 的英文名称有 primary immune thrombocytopenia、idiopathic thrombocytopenic purpura、immune thrombocytopenic purpura 和 primary thrombocytopenic purpura。因此，以上述英文名称为关键词分别在OMIM数据库、TTD数据库、GAD数据库和GeneCards数据库查找ITP的相关靶点。

2.3 八珍汤治疗ITP的相关靶点获取

为了阐述八珍汤治疗ITP 的作用机制，本文将八珍汤的作用靶点与预测得到的ITP 作用靶点进行合并取其交集，共有靶点即认为是八珍汤治疗ITP 的相关靶点。然后将获取的靶点上传到STRING 数据库，构建蛋白质相互作用网络，分析核心靶点。

2.4 八珍汤治疗ITP的相关靶点富集分析

本文利用Cytoscape 3.7.1 软件中的ClueGO 插件对八珍汤治疗ITP 的相关靶点进行基因本体（GO）富集分析，选择生物过程（biological process），设置P≤0.01。通过DAVID 在线分析工具实现对靶点的KEGG生物通路富集分析。通过KEGG数据寻找富集出来的生物通路，借助Omicshare获取的KEGG生物通路富集分析结果绘制成气泡图。

3 结果

3.1 八珍汤化学成分的收集与筛选

利用 TCMSP 数据库，以 OB ≥30% 和 DL ≥ 0.18 为筛选条件从八珍汤各组成药味中收集到了160个化合物。其中甘草的化学成分最多，有92个；人参次之，有22 个成分；茯苓有15 个成分；白芍有13 个成分；白术有7个成分；川芎有7个成分；当归有2个成分；熟地黄有2 个成分。除上述成分之外，基于文献研究我们了解到还有9 个化学成分具有广泛药理活性，但因不满足OB 和DL 的筛选条件未被纳入，此次也将它们作为候选化合物纳入研究。例如阿魏酸在血小板聚集和血栓形成等方面具有显著效果，同时还表现出了抗氧化、抗炎以及免疫调节等作用[18]。藁本内酯在抗炎和免疫调节等方面也表现出了很好的药理作用[19]。因此，共筛选得到169个八珍汤所含的化学成分，其中白芍 14 个、人参 23 个、甘草 92 个、茯苓 15 个、白术 7 个、川芎7 个、当归6 个、熟地黄5 个。删除重复后共获得159个成分。

3.2 靶点预测

利用TCMSP 分析平台，对从八珍汤中筛选出的159 个化合物进行来源于Drugbank 数据库的靶点预测，其中芍药苷、黄甘草苷、苯甲酰芍药苷等28个化合物在该数据库中没有靶点。总共获得了八珍汤中131个化合物的靶点，靶点总数为1823 个。其中，白芍99个、人参 204 个、甘草 1272 个、茯苓 28 个、白术 20 个、川芎36 个、当归106 个、熟地黄58 个。去除重复后总共得到146个靶点。

3.3 成分-靶点网络构建与分析

以八珍汤中筛选出的化合物和靶点为基础建立成分-靶点网络图（图1）。该网络包含277 个节点和1823条边，131个化合物的网络节点度中位数为11，表明大多数化合物影响多个靶点。其中山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素的网络节点度分别为118、87、84和70，它们在网络中处于核心位置。因此，山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素可能是八珍汤关键的多效活性成分。

3.4 ITP相关靶点

以ITP 各英文名称为关键词分别在OMIM 数据库、TTD 数据库、GAD 数据库和 GeneCards 数据库中进行搜索，在OMIM 数据库中查找到6 个ITP 相关靶点，在 TTD 数据库中查找到 4 个 ITP 相关靶点，在 GAD 数据库中查找到18 个ITP 相关靶点，在GeneCards 数据库中查找到303 个ITP 相关靶点，删除重复后总共得到306个ITP相关靶点（图2）。

图1 八珍汤的成分-预测靶点网络

3.5 八珍汤治疗ITP的相关靶点

将八珍汤的作用靶点与预测得到的ITP 作用靶点进行合并取其交集后共获得21个靶点，分别为BCL2、CCL2、F3、F7、HMGCR、IFNG、IGHG1、IL1B、IL2、IL6、KDR、MPO、NOS3、NR3C1、PLAT、PPARG、PTGS2、PTGS2、SELE、THBD、TNF、VEGFA（图3）。

3.6 八珍汤治疗ITP相关靶点的富集分析

为了进一步阐述八珍汤治疗ITP 的作用机制，本文利用Cytoscape 3.7.1 软件中的ClueGO 插件对八珍汤治疗ITP 的相关靶点进行生物过程的富集分析。以P＜0.01 为条件进行筛选，富集到114 个生物过程（图4）。图中每个圆点都代表一个生物过程，用圆点大小表示P值的大小，圆点越大说明P值越小。其中positive regulation of vitamin metabolic process、positive regulation of endocytosis、regulation of endothelial cell proliferation、positive regulation of leukocyte cell-cell adhesion 和response to glucocorticoid 富集程度显著。应用DAVID 分析工具对相关靶点进行KEGG 富集分析，筛选得到P＜0.05 的 KEGG 通路 34 条，选择前 20 条通路构建气泡图（图5）。图中圆点的颜色和大小反映了与通路相关联的基因数量及P值，P值越小颜色越偏于红色，相关联基因的数量越多圆点则越大。结果显示，八珍汤治疗ITP 的机制主要涉及TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway 和 VEGF signaling pathway 等 通 路 。八珍汤治疗ITP 相关靶点的蛋白质相互作用网络（图6）中红色的点为TNF信号通路相关的靶点。

4 讨论

图2 ITP相关靶点网络图

图4 八珍汤治疗ITP候选靶点的GO富集

ITP 是最常见的自身免疫性血细胞减少症，其特征在于短暂或持续减少的血小板计数[20,21]。ITP 的发生源于抗血小板自身抗体的产生导致网状内皮系统特别是脾中的血小板破坏[22]。ITP患者伴有瘀伤，皮肤出血和不常发生的严重出血（包括颅内出血）[23]。此外，ITP 患者的生活质量因身体症状、心理症状、恐惧、社交活动减少和工作能力下降而恶化[24]。新诊断的ITP 患者的标准疗法是止血和通过药物增加血小板计数，但这些药物往往具有严重的副作用[25]。考虑到高昂的治疗费用，ITP 患者将面临巨大的经济负担，特别是患有严重疾病的患者[26]。从中医理论解释，ITP是一种因脾不统血而引起血溢脉外的疾病，临床表现为血热妄行、气不摄血、阳虚火旺、瘀血阻络等，治疗方法一般包括清热凉血、健脾益气、滋阴清热、活血通络等[27]。八珍汤、归脾汤等中药是中医临床治疗ITP 的常用方剂。八珍汤具有气血双补的功效，研究表明八珍汤具有抑制血小板聚集、增强机体造血功能的作用，并可以通过调节免疫功能发挥治疗ITP的作用[28]。

本研究运用网络药理学的方法探讨八珍汤治疗ITP的可能作用机制。首先通过TCMSP数据库和文献报道从八珍汤配伍中药人参、茯苓、白术、甘草、当归、川芎、白芍和熟地黄中总共筛选出159 个化学成分进行靶点预测分析，总共得到146 个靶点。TCMSP 数据库是中药网络药理学研究中常用的工具之一，其独特优势在于可通过ADME 参数对中草药所含化学成分进行筛选，提高结果的准确性。但也有一定的局限性，如在以OB 和DL 为条件进行成分筛选时，一些被纳入的成分在治疗相关疾病方面可能不具有相关活性，而还有一些具有相关药理作用的成分由于不满足筛选条件而没有被纳入，这时就应该通过查阅文献的方式手动将这些成分纳入。在本研究中阿魏酸、藁本内酯等9个化合物即为具有相关药理活性但不满足筛选条件而手动纳入的成分。在八珍汤的作用靶点分析中，虽然预测得到的各化学成分靶点数量不同，但有些成分靶点的重叠程度却很大，也就是说八珍汤中的各成分具有共同或相似的靶点，起到协同增效的作用。在成分-靶点网络，八珍汤的131个化合物的网络节点度中位数为11，说明大多数化合物都具有多重靶点。其中山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素的网络节点度最高，它们在网络中处于核心位置。因此，它们可能是八珍汤关键的多效活性成分。

图5 八珍汤治疗ITP候选靶点的KEGG通路富集

图6 八珍汤治疗ITP相关靶点的蛋白质相互作用网络

为了揭示八珍汤治疗ITP 的作用机制，将八珍汤作用靶点与ITP 相关靶点进行合并取其交集，即为八珍汤治疗ITP 的相关靶点。通过对八珍汤治疗ITP 相关靶点的基因功能和KEGG 生物通路的富集分析，得到八珍汤治疗ITP相关靶点主要涉及的生物过程和相关生物通路的信息。八珍汤治疗ITP主要涉及内吞作用的正调控、内皮细胞增殖的调控、白细胞粘附的正调控、维生素代谢过程的正调控和糖皮质激素的应答等生物过程，在生物通路方面主要包括TNF 信号通路、NOD 样受体信号通路、HIF-1 信号通路、VEGF 信号通路等。此外，单纯性疱疹感染、麻疹、Toll 样受体信号通路、T 细胞受体信号通路等也被显著富集。卢柠[29]的研究发现，ITP 患者外周血中的TNF-α明显高于正常组，在经过治疗后TNF-α显著下降，说明TNF-α参与了ITP 的发病机制。据文献报道，疱疹类病毒、麻疹病毒、肝炎病毒、人类微小病毒B19 等也与ITP 的发生具有密切关联[30]。王艺超等[31]对ITP 患者和正常人的脾巨噬细胞通过高通量基因芯片技术进行基因表达的分析，并对患者的差异表达基因进行生物通路分析，研究结果显示Toll 样受体信号通路、T 细胞受体通路等为主要通路。张雪皎[32]通过对ITP 患者细胞因子的研究发现，趋化因子信号通路JAK-STAT 信号通路、Toll 样受体信号通路、MAPK 信号通路的改变与疾病的发生有关。徐颜美[33]对汉族人群ITP 患者进行了全基因组关联的研究，结果发现JAK-STAT信号通路、癌症通路等与ITP 的发生有关。随涛等[34]通过筛选ITP 患者血浆差异microRNA，并对靶基因进行富集分析发现，ITP 与钙离子信号通路、MAPK 信号通路、GnRH 信号通路等密切相关。曾艳等[35]通过对比研究ITP 患者和健康人Treg 细胞microRNA 的表达，发现ITP 与MAPK 信号通路、代谢通路、钙离子信号通路和T 细胞受体通路等相关。在八珍汤治疗ITP 相关靶点的蛋白质相互作用网络中，TNF、IL6、SELE、CCL2、IL1B 和PTGS2 这6 个TNF 信号通路相关靶点在网络中处于核心位置，说明TNF 信号通路可能是八珍汤治疗ITP的关键机制。

本研究利用网络药理学的方法研究八珍汤治疗ITP 的作用机制，发现八珍汤可能通过内吞作用的正调控、内皮细胞增殖的调控、白细胞粘附的正调控、维生素代谢过程的正调控和糖皮质激素的应答等生物过程发挥治疗ITP 的作用；其作用机制可能与TNF 信号通路、NOD 样受体信号通路、HIF-1 信号通路、Toll样受体信号通路癌症通路、T 细胞受体信号通路和VEGF 信号通路等有关，其中TNF 信号通路可能是八珍汤治疗ITP 的关键机制。在八珍汤众多化学成分之中，山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素可能是其发挥治疗ITP作用的关键多效活性成分。