七氟烷暴露对发育大鼠海马神经元可塑性的影响及机制*

宗川曰，李茂

(1.徐州医科大学附属淮安医院麻醉科，淮安 223002；2.江苏省淮安市妇幼保健院麻醉科，淮安 223002)

七氟烷是一种常用的挥发性麻醉药，其麻醉作用可能是活化γ-氨基丁酸A型(gama-aminobutiric acid A，GABA-A)受体和(或)抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体，从而抑制突触传递，并导致遗忘、意识不清和镇痛相关的麻醉状态[1]。GABA-A受体功能增强，也可以抑制神经元的可塑性并导致认知障碍[2]。研究发现，当发育中的大脑暴露于七氟烷时，可以导致实验大鼠广泛神经变性和神经认知功能障碍[3-4]。全身麻醉对儿童手术后的影响是医疗界关注的焦点[5-8]，尤其是神经细胞凋亡和神经损伤在介导学习记忆障碍中的作用[9]，推测突触发育和神经元可塑性的缺陷是认知异常的基础[10]。笔者在本研究以SD大鼠为动物模型，采用3%七氟烷对大鼠进行麻醉(浓度接近于临床上婴幼儿七氟烷麻醉剂量)，观察大鼠海马兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)、突触融合蛋白、人突触相关蛋白25(SNAP25)及突触素α-突触核蛋白及树突棘密度等指标，探讨七氟烷对发育中大脑神经元可塑性的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级20 d Sprague-Dawley雄性幼鼠60只，体质量(45±4.7) g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2018-0006。

1.2试药 七氟醚(江苏恒瑞医药有限公司，批号：16043031)；小鼠抗大鼠突触融合蛋白单克隆抗体(批号：2018-AA4562)，小鼠抗大鼠SNAP-25单克隆抗体(批号：2018-AC8520)，小鼠抗大鼠突触速单克隆抗体，小鼠抗大鼠α-突触核蛋白单克隆抗体，均购自上海碧云天生物科技有限公司；Golgi-Cox染色试剂盒(上海起发实验试剂有限公司，批号：502997)。

1.3仪器 标准Morris水迷宫(上海软隆科技发展有限公司)；TG22-WS台式高速离心机(长沙湘锐离心机有限公司)；奥林巴斯DSX100光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；赛默飞桌面型透射电子显微镜(赛默飞公司)；新物体识别测试系统(上海欣软信息科技有限公司)。

1.4实验分组 实验大鼠出生后第7天使用随机数字表法分为对照组、3%七氟烷1 h组(Sev 1 h组)和3%七氟烷6 h组(Sev 6 h组)，每组20只。将仔鼠麻醉[11]，置于用3.0%七氟烷、空气通风的盒中，并以约1 L·min-1的流速处理，气体采样管线连续监测麻醉箱内的气体。密封箱内的温度用加热垫保持在(30±1)℃，大鼠6 h麻醉总存活率为100%；对照组接受空气，无麻醉剂暴露。在体实验在干预完成后第2天实施，在体实验结束后取标本进一步检测。

1.5大鼠学习记忆能力

1.5.1定位航行实验测试学习能力 将大鼠置标准Morris水迷宫(MWM)实验记录大鼠逃避潜伏期，测试海马依赖的空间认知[12]。每只大鼠每天进行4次试验(间隔30～35 min)，连续5 d。每个实验包括将鼠面向池壁放入水中，动物逃上平台的时间(逃避潜伏期)试验持续时间为60 s，所有实验都进行录像，用ANY-maze跟踪系统记录大鼠游泳路径。

1.5.2空间探索实验 实验第6天时进行空间探索实验，撤去平台，大鼠面向池壁放入水中，记录仔鼠在60 s内平台象限游泳时间及经过平台次数。

1.6仔鼠脑组织取材 认知功能实验完成第2天，对各组仔鼠进行取材。经大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg·kg-1)麻醉，取尾静脉血后处死大鼠，夹闭腹主动脉、剪开右心耳，4 ℃，灌注大鼠4%多聚甲醛50～100 mL、速度先快后慢，共用30 min，至右心耳流出液体基本澄清；冰上分离脑组织，剥离双侧海马，一侧海马浸入4%多聚甲醛溶液中，置4 ℃固定24 h后备切片；另一侧海马组织匀浆后离心20 min、转速3000 r·min-1，收集上清液。

1.7突触融合蛋白(syntaxin)、SNAP25及突触素α-突触核蛋白检测 取海马组织1 g进行匀浆，以4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min，取上清液。通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并湿电转移到硝酸纤维素膜5%脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃下用抗突触融合蛋白(1：200)、抗SNAP25(1：4 000)、抗突触素(1：1 000)、抗-α-突触核蛋白(1：1 000)及第一抗体孵育过夜，与相应的第二抗体在室温孵育1 h，化学发光显影，Gel-Pro分析仪吸光度量化[11-13]。

1.8高尔基染色检测树突棘密度 取海马组织切片，用FD Rapid GolgiStainTMKit进行Golgi-Cox染色，用光学显微镜观察[14-15]，从每个锥体神经元中随机检查10 μm顶端树突5个，以量化树突棘密度，计算每10 μm树突长度的脊柱密度。

1.9透射电子显微镜观察海马突触的超微结构 取海马组织切片，用树脂包埋，3%醋酸铀酰染色20 min和0.5%柠檬酸铅染色5 min。透射电子显微镜观察海马突触的超微结构变化，使用图像软件Image Pro Plus 6分析[16-17]。

1.10海马切片fEPSP 参照文献[18]制备海马组织切片[Leica VT 1200 S切片系统(厚400 μm)]，切片移到32 ℃的接口室，灌注充氧ACSF，细胞外记录海马CA1区fEPSP。将双极涂覆搪瓷的铂刺激电极置于Schaffer侧支/连合纤维中，并在显微镜下将装有ACSF的玻璃记录电极置于CA1的锥形细胞中，收集1 min内fEPSP，用fEPSP最大初始斜率30%～50%的刺激强度刺激CA1区锥形细胞，记录5 min内fEPSP，取平均值。对于区域CA1中长时程增强(long-term potentiation，LTP)诱导以5 min的间隔交付3个高频刺激(high frequency stimulation，HFS)阵列(100 Hz，1 s)，长时程抑制(long-term drepression，LTD)诱导低频刺激(low frequency stimulation，LFS，1 Hz，15 min)；在HFS或LFS后，记录fEPSP幅度的变化，用Clampex 9.0和Clampfit 9.0(AXON、USA)记录和分析数据。

1.11通过新物体识别任务测量相对时间的辨别指数(discrimination index，DI) 参照文献[19-21]。在完成MWM测试后，在新物体识别测试中评估大鼠，评估背景是两个相同大小，且独立的领域(方底61 cm、墙高50 cm)，背景1有黄色的墙壁和一个覆盖着木质效果的乙烯衬里的基地，而背景2则有黑色的墙壁和一个黑色的塑料基地，视觉线索被放置在每个环境中3个不同的墙上。在测试之前，受试动物先要习惯背景。对一个物体的调查被定义为嗅探或将鼻子放在1 cm的范围内，动物适应实验环境2 d，确定探索实践后开始测试；先进行一次单独的试验，其中一半在背景1中测试，另一半在背景2中测试。每个试验的测试阶段都发生在相反的环境中，表示探索每个对象所花费的相对时间的DI=(新对象调查时间-熟悉对象调查时间)/调查总时间。

2 结果

2.1突触蛋白表达 Sev 6 h组中syntaxin和SNAP-25表达较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)。Sev 1 h 组syntaxin表达较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)；SNAP-25表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，Sev 1 h组和Sev 6 h组突触素、α-突触核蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2树突棘密度 在高尔基染色下检测到全浸渗的CA1锥体细胞，在光学显微镜下用100倍油浸物镜分析顶端树突的棘突。本研究只确定树突棘的密度，因为一些不同类型的棘并不总是清晰可见，如树枝状的细枝状、蘑菇状或分枝状的树突。对照组脊柱密度为(12.51±0.38)/10 μm，Sev 6 h 组和Sev 1 h 组分别为(9.81±0.21)/10 μm和(10.53±0.29)/10 μm，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3七氟烷诱导海马突触的超微结构改变 海马突触七氟烷暴露2周后，使用TEM检查海马的突触超微结构。与对照组比较，Sev 6 h组突触数目减少，差异有统计学意义(P<0.05)，突触间隙明显增宽(P<0.01)，见图2和表1。另外，Sev 6 h组海马突触前端部分线粒体出现肿胀、皱缩、空泡化等病理改变。Sev 1 h组，突触间隙的宽度与对照比较亦增加(P<0.01)，而突触的数量保持不变。3组突触后密度(PSD)和突触曲率的厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4对LTP和LTD的影响 电生理结果显示，对照组、Sev 1 h组和Sev 6 h组EPSP斜率基线比较差异无统计学意义(P>0.05)，HFS后EPSP斜率明显升高。Sev 6 h组EPSP斜率明显低于对照组和Sev 1 h组，差异有统计学意义(P<0.05)。提示Sev 6 h海马DG区的LTP功能受损，见图3，表2；相反，单次脉冲LFS诱导NMDA受体依赖性LTD在Sev 6 h组海马切片中完整。在应用LFS之前，对照组、Sev 1 h组和Sev 6 h组EPSP斜率基线差异无统计学意义(P>0.05)，连续15 min LFS，LTD在3组所有海马脑片成功诱导。EPSP斜率下降，稳定后对照组、Sev 1 h组和Sev 6 h组EPSP斜率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

图2 3组大鼠海马突触超微结构(×10 000)

表1 3组大鼠海马突触界面的参数结果

组别突触数目/[个·(mm2)-1]PSD厚度突触间隙宽度nm突触曲率/%对照组0.52±0.07145.73±4.1217.64±0.971.016±0.005Sev 1 h组0.43±0.03141.17±1.7120.33±048①1.015±0.003Sev 6 h组0.34±0.03243.78±2.0721.80±0.61①1.011±0.003

①与对照组比较，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05.

表2 3组LTP后EPSP斜率

组别基线EPSP斜率HFS后EPSP斜率稳定后EPSP斜率对照组100.58±1.63201.41±12.50171.20±6.91Sev 1 h组102.13±1.01215.36±14.99181.24±12.59Sev 6 h组100.30±2.92171.58±14.55141.48±7.97

表3 3组LTD后EPSP斜率

组别基线EPSP斜率LFS后EPSP斜率稳定后EPSP斜率对照组100.82±1.5964.36±3.8870.77±4.47Sev 1 h组100.44±2.0761.43±3.7573.74±3.10Sev 6 h组101.81±1.2862.77±4.5471.85±6.01

2.5大鼠的学习和记忆能力

2.5.1Morris水迷宫任务 Morris水迷宫测试数据显示，七氟烷暴露大鼠1～3 d逃避潜伏期无显著影响(P>0.05)。从第4天起，Sev 6 h组大鼠探测时间和逃避潜伏期较对照组延长(P<0.05)，见图4A、B，平台象限区(1.67±0.37)的入口数量少于Sev 1 h组(3.11±0.39)和对照组(3.12±0.45)(P=0.027)，见图5C和D，提示新生大鼠暴露于3.0%七氟烷6 h后P60-65的空间学习和记忆能力受损。对照组和Sev 1 h组大鼠逃避潜伏期比较差异无统计学意义。

图4 3组Morris水迷宫测试逃避潜伏期

Fig.4 Detection time in Morris test of three groups

2.5.2新物体识别任务 通过增加新物体的探查时间，对照组大鼠能够区分熟悉的和新颖的物体，Sev 1 h组和Sev 6 h组大鼠对于熟悉的物体记忆回忆受损。新对象识别的对照组DI>0(P=0.004)，高于Sev 6 h组(P<0.05)，而Sev 1 h组与Sev 6 h组DI值之间比较，差异无统计学意义(P= 0.876，0.121)，见图5。

A，B.新物体；C，D.物体背景

图5 3组大鼠新物体识别和辨别指数结果

A,B.novel object; C,D.object-contex

Fig.5 Result of the novel object and object-contex recognition and discrimination index in three groups of rats

3 讨论

海马锥体神经元的树突棘一直被认为是突触可塑性的形态基础[22]。脊柱形状和密度的改变是与多种人类神经疾病相关的认知功能改变的最一致的解剖相关性[23]。这种结构可塑性可以被吸入麻醉药阻断，这被认为与阻断基于肌动蛋白的运动有关[24]。相反，BRINER等[25]发现吸入麻醉药和静脉麻醉药急性增加P16大鼠内侧前额叶皮质的树突棘密度[26]。但在另一项研究中，YANG等[27]发现异氟醚对1个月龄小鼠皮层树突棘的发育和可塑性无明显影响。早期暴露于常用的全身麻醉药诱导海马超微结构显著损伤[29-30]。透射电子显微照片显示，七氟烷暴露组的突触超微结构受到负面影响，包括突触数目减少、突触间隙增宽等病理特征。以前的研究表明，七氟烷可以降低突触后密度蛋白95的水平。然而，本研究没有观察到3组间PSD的厚度差异。这可能是因为PSD-95表达水平不能完全反映PSD的厚度。本研究发现突触囊泡相关蛋白(SVAPs)的表达，涉及对接，融合和突触小泡的再循环，以及神经递质释放(胞吐作用)。在这项研究中，表达的SNAP-25和syntaxin，蛋白质所需的膜融合和锚定在囊泡运输膜，在Sev 6 h组与对照组相比显著升高。这些蛋白质是SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白质附着蛋白质受体)的两个组分，其对于刺激突触中的囊泡神经递质释放是强制性的。虽然适度升高，但它们的表达水平可能影响SNARE复合物形成的规则偶联。突触和α-突触核蛋白在调控胞吐过程中发挥作用，在七氟烷暴露后没有发现变化。本研究只测量所有SVAP中4个，因此七氟烷暴露后囊泡总数的变化是否仍然有待研究。笔者推测，突触结合蛋白的相对水平存在不平衡，这可能与突触破坏的形态学指标相平行。因此，记忆储存和突触传递的解剖基质的改变意味着长期受到干扰的突触发育的可能性，其导致认知过程中的长期损害。麻醉后LTP抑制可能解释术后认知功能障碍，因为LTP被广泛认为是记忆巩固和回忆的相关因素。有研究报道七氟烷可能会增加海马的LTP，浓度范围从亚临床到临床。本研究的电生理结果显示3%七氟烷暴露6 h显著抑制海马切片制剂中的LTP。突触可塑性通常伴随着突触的结构修饰，例如，LTP需要树突棘的功能完整性。七氟烷引起P21突触形态和结构发生的改变可能与LTP抑制P35-42有关，导致P60-75的学习和记忆障碍。在LTP没有变化的情况下，Sev 1 h组树突棘密度也有所减少，表明七氟烷引起的LTP损伤是由于突触发育的多重而非单一作用所致。

新生儿在啮齿动物和非人灵长类动物中接触全身麻醉会产生持续到成年期的神经行为缺陷。最近的流行病学研究也表明，年幼儿童的麻醉药物治疗可能与晚年的神经认知障碍有关。鉴于过多的研究支持海马突触可塑性在记忆获取和编码中的作用，本研究测试新生大鼠七氟烷暴露是否会影响两种不同形式的海马依赖性学习和记忆。本研究仅在Schaffer侧支CA1途径中显示LTP，与对照组和Sev 1 h组比较，Sev 6 h组能够解释空间学习和记忆障碍。由于早期神经发育的复杂性和全身麻醉药的多效性，其不良行为表型可能由于剂量，时间和暴露时间的细微差异而产生。长时间的吸入性麻醉剂暴露导致树突棘形态改变，突触丢失[29]，空间参考记忆和空间工作记忆，且与短期相比有神经认知缺陷。本研究还观察到七氟烷暴露持续时间对突触可塑性和认知能力的影响，发现突触结构和形态学改变显示出类似的损伤，尽管Sev 6 h组中SNAP-25的表达与Sev 1 h组相比更高。然而，LTP是突触可塑性替代物的损害仅限于Sev 6 h组的大鼠。因此，本研究发现在Morris水迷宫测试中，只有Sev 1 h组，而不是Sev 1 h组的空间记忆获得受损。在新物体识别任务中，来自七氟烷处理组的大鼠均未能将新物体与熟悉的物体区分开来，这表明即使是单一的短暂麻醉经验也会损害简单的非空间任务表现。“阈值效应”的概念可以解释暴露持续时间对突触可塑性的功能差异，即两个七氟烷组的成年期结构和形态学变化的相似性可归因于部分突触恢复与神经发育。

综上所述，麻醉暴露持续时间可能对神经可塑性和神经认知表现有不同的影响。