乌海地区铜绿假单胞菌耐药基因研究分析

孙金莲，孙桂苓，王院，孙建雯

（乌海市人民医院检验科，内蒙古 乌海 016000）

PDRPA是引起呼吸道感染也是临床上分离率较高、其致病性强耐药率高，是引起临床感染的常见的主要病原菌之一，该菌感染造成多重耐药性是院感科监测的重点[1]。其多重耐药性与其产生生物膜、膜孔蛋白形成及多种耐药基因产生有密切关系[2]，由于β2内酰胺类抗生素的广泛使用和碳青酶烯酶的产生及细胞膜通透性降低造成抗菌药物失活。该菌感染主要发生在ICU、呼吸内科和神经外科分离率明显增高，近几年对多种抗菌药物的耐药性呈明显上升趋势，经抗菌药物合理使用和正确干预耐药性均有所下降。

1 材料与方法

1.1 标本来源 采取2018年1月-2019年12月引起我院门诊及住院患者感染送检的各种标本培养共分离出该菌62株，标本主要为痰液、伤口分泌物、尿、无菌体液、支气管灌洗液，血液严格采集非同一患者不同部位分离到的菌株。

1.2 菌株分离与鉴定 PCR扩增仪（Eppendorf公司）；凝胶成像分析系统（北京六一WD-9413B）；PCR扩增试剂盒、核酸染料Mastermix（货号pc1120）、细菌基因DNA提取试剂盒（货号D1600）、TAE缓冲液（货号T1060）均购自北京华大基因生物技术有限公司。

1.3 细菌总DNA提取片段 组成分别为：2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp本品已含有1×loadingBuffer的DNA溶液，提取的DNA可取8 μL直接电泳。

1.4 PCR扩增基因引物设计 参照文献，由北京华大基因生物技术有限公司合成目的基因片段。β-内酰胺酶：TEM-P1：CTGAATGAAGCCATACCAAA；P2：TGTAGATAACTACGATACGGGAG。VEB-P1：GCGGTAATTTAACCAGA；P2: GCCTATGAGCCAGTGTT。CRAB-P1：AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC；P2：TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC。OXA-10P1：AATGGTGTTTTCGTGCTTT；P2：TTCTTACTTCGCCAACTTCT。金属β-内酰胺酶： IMP-P1：CGGCCTCAGGAGAGGCTTT；P2:AACCAGTTTTGCCTTACTAT。VIM-P1：TCCGACAGTCAGCGAAT；P2 :GCAGCACCAGGATAGAAGA。DHA P1：AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT；405P2：CCGTACGCATACTGGCTTTGC。氨基糖苷类修饰酶：aac（6＇）-Ib P1：ATGACTGAGCATGACCTTGC；P2：TTAGGCATCACTGCGTGTTC。aac（6＇）-II P1：TTCATGTCCGCGAGCACCCC；P2：GACTCTTCCGCCATCGCTCT。ant（2＇）-I P1：GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG；P2：CTGTTACAACGGACTGGCCGC。qacE△1-sul1P1：TA GCGA GGGCTTTACTAA GC；P2：CTGAATGAAGCCATACCAAA。膜孔蛋白：OprD2 P1：TGTAGATAACTACGATACGGGAG；P2：GCGGTAATTTAACCAGA。SHV P1：GGTTATGCGTTATATTCGCC786；P2：TCCCGCAGATAAATCACCA。PER P1：AGTCAGCGGCTTAGATA 978；P2：CGTATGAAAAGGACAATC。为避免非特异性扩增，反应体系需在冰上配置；反应开始前预热PCR仪至95oC，将反应体系充分混匀离心后置于PCR仪上开启反应体系：98oC预变性5 min、变性15 s，55oC退火30 s 75oC延伸1 min，反应1个循环，75oC补充延伸5-10 min。

2 结果

2.1 共分离该菌62株（剔除同一患者重复菌株） 关于B2内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检测结果显示分别为：TEM 68.8%、OprD2 21.9%、VIM 15.3%、IMP 9.4%、SHV 9.4%和DHA 6.3%，未检出OXA、PER及CRAB基因。

2.2 氨基糖苷类修饰酶基因检测结果 62株该菌检出氨基糖苷类修饰酶（AMEs）基因检出率为56.9%。各基因检出率从高到低分别为aac（6＇）-Ib为23.3%、aac（6＇）-II为19.4%、ant（2＇）-I为14.2%。

2.3 消毒剂与磺胺类和氟喹诺酮类耐药基因检测结果 62株该菌检出qacE$2sul1耐药基因检出率为28.1%，氟喹诺酮类耐药基因qnr阴性。

3 讨论

该菌属非发酵菌属在自然界分布广泛，医院对该菌的分离率较高，全院致病菌排名前五位。该菌是引起医院感染的重要病原菌，在治疗中不断产生多药耐药性与临床大量使用高级抗生素有关[3]。其主要耐药机制是膜孔蛋白结构和功能改变、质粒及染色体的变异、易产生抗生素降解酶、修饰酶、生物膜的形成等[4]，该菌感染造成临床治疗困难。PCR结果显示氨基糖苷类修饰酶、TEM型β2内酰胺酶、qacE△1-sul1、VIM型金属β2内酰胺酶等基因扩增阳性，oprD2基因扩增检测呈缺失型造成相应类别抗生素耐药[5]。尤其对碳氢酶希类、β-内酰胺类、头孢菌素类、氨基糖苷类等抗生素均高度耐药，对喹诺酮类耐药率较低。质粒中含有大量金属β2内酰胺酶基因造成广泛传播,质粒可以同时携带多种灭活药物的修饰酶形成多重耐药机制。同时临床的不规范抗生素使用加快了耐药的出现降低了治疗效果，对ICU重度感染的患者采取降阶梯联合治疗可以提高抗感染效果。随着抗生素的广泛使用耐药性上升已成为临床抗感染的严峻课题。因此加强细菌耐药监测为临床提供科学依据，控制多重耐药菌的产生有着十分重要意义。医院应严格控制高级别抗生素的用药指征，应动态监测送检标本依据药敏结果正确选择抗菌药物减少耐药菌株的产生。同时院感科应不断加强多重耐药菌的控制，切断感染源和传播途径采取有效措施防止院感爆发流行。