海南油茶种仁蛋白质提取及双向凝胶电泳-质谱初步鉴定

叶洲辰，吴友根，于 靖，张军锋，杨东梅，胡新文

(海南大学 热带农林学院，海口570100)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)家族中的一种常绿小乔木或灌木[1]，与油桐、核桃、乌桕齐名，是我国重要的纯天然高级油料作物[2]，同时与橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料树种，具有较高的栽培价值和生态效益[3]。我国是油茶的原产地和主产地，该植物主要分布在江西、湖南等长江以南省份的高山丘陵地带[4]。油茶籽油的脂肪酸组成与橄榄油类似，且富含维生素、茶多酚、角鲨烯等活性成分，被誉为“油中软黄金”，是联合国粮农组织(FAO)重点推广的高级食用植物油[5]。然而我国油茶籽油产量远不能满足人们的需求，尤其是海南油茶，该省地处油茶资源分布的最南缘，海峡隔离，亚热带季节明显，孕育了独具特色的油茶资源，但含油量低却是制约该产业发展的一个关键因素。因此，提高油茶籽油产量对解决当前我国食用油市场短缺具有重要意义[6]。

国内外关于油茶的研究多集中于良种选育、低产改造、砧木嫁接、促花保果、组织培养和药理活性检测等方面，其重要代谢产物的合成过程及调控机制仍不明确，随着基础分子生物学技术的开展，如油茶组织DNA和RNA提取方法优化[7-8]，SRAP、SCAR、ISSR等分子标记体系建立[9-11]，以及关键基因克隆与遗传转化等[12]，油茶籽油的生物合成过程被初步了解，但mRNA水平所提供的基因表达信息尚未能完整揭示这些合成代谢途径的分子调控机制。基因功能的执行者是蛋白质，我们通常是以蛋白质组为研究对象，通过大规模、高通量的分析蛋白表达量，探究油茶代谢途径中其所发挥的作用模式及功能机理[13]。单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向凝胶电泳(2-DE)是蛋白质组学研究的主要技术，通过与分子生物学手段协作，获取相应的关联信息，并根据凝胶上每个蛋白点的存在与否、丰度及位置来可视化分析从核酸层次到蛋白质水平上的转变，这将有助于找出与油脂合成积累相关的重要蛋白，从而调控油料的含油量与产油质量[14]。近年来对于不同物种叶片[15]、种子[16]及花蕊[17]等的蛋白质提取优化研究已相对成熟，但油料作物种仁蛋白质组学分析技术起步较晚，且油茶属于多年生木本植物，其种仁富含大量油脂、色素、酚类等次生代谢物质，在提取过程中会对蛋白样品制备及凝胶电泳结果造成干扰，而目前关于海南油茶种仁蛋白提取方法筛选及双向凝胶电泳-质谱鉴定等方面的研究却鲜有报道。鉴于此，本研究以海南油茶成熟种仁为试验材料，优化了从油茶种仁中提取高质量蛋白的方法，并进行了油茶种仁蛋白的双向凝胶电泳分析，同时结合质谱鉴定手段和Mascot Distiller软件进行检索，旨在对今后深入开展油茶种仁蛋白质组学研究提供参考，以期为进一步培育出更适于海南食用油产业发展的高品质油茶良种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

供试样品于2018年11月采自海南省琼海市阳江镇油茶种质资源基地(19°12′10"N; 110°24′32"E)，经海南大学杨好伟教授鉴定为CamelliaoleiferaAbel.，油茶果采摘后去壳破皮，将种仁速冻于液氮中，并带回实验室贮存在-80℃冰箱备用。

十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、牛血清白蛋白(BSA)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙硫酸(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、维生素C(VC)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、胰蛋白酶、硫脲和尿素均购自美国Sigma公司；IPG缓冲液(IPG buffer, pH 4～7)、线性24 cm IPG胶条(pH 4～7)、矿物甘油和琼脂糖均购自瑞典GE Healthcare公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、考马斯亮蓝(CBB-G250)、溴酚蓝(BPB)和β-巯基乙醇(BME)均购自美国Bio-Rad Labs；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Tris饱和酚(pH>7.8)、三羟甲基氨基甲烷和甘氨酸均购自北京索莱宝科技有限公司；四硼酸钠、蔗糖、乙腈、硫酸铵、碳酸氢铵、氯化钙、甲醇、丙酮、乙酸、磷酸、乙醇，分析纯，均购自北京化学试剂厂。

1.1.2 仪器与设备

Mettler Toledo AL204型电子分析天平(香港长江和记宝业有限公司)，CT15RT型高速冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司)，UV-1000型紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，SY21-K型数显恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司)，DHG-9030A型烘箱(上海一恒科技有限公司)，THZ-300C型恒温摇床(上海一恒科技有限公司)，Ettan IPGphor 3型等电聚焦仪(瑞典GE Healthcare公司)，Ettan DALTsix型垂直电泳仪(瑞典GE Healthcare公司)，Image Scanner III型投射扫描仪(瑞典GE Healthcare公司)，5800 MALDI-TOF MS/MS型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(美国AB SCIEX公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 海南油茶种仁蛋白提取

1.2.1.1 油茶种仁预处理

将采集的海南油茶种仁样品分为2组，每组3份生物学重复，每份各称取1.0 g，分别置于预冷研钵中，加入适量1.0% PVPP，用液氮充分研磨至粉末后，-80℃保存备用。分别采用TCA-丙酮沉淀法和BPP抽提法提取油茶种仁蛋白。

1.2.1.2 TCA-丙酮沉淀法

参考Wang等[18]的方法并适当改进。取1.0 g海南油茶种仁粉末，加入10 mL预冷的10% TCA-丙酮溶液(PMSF 1.0 mmol/L, DTT 10 mmol/L)，充分混匀后，-20℃静置过夜；于4℃、12 000 r/min离心30 min，弃上清；再加入10 mL预冷的10% TCA-丙酮溶液，旋涡振荡至沉淀物分散，-20℃静置2 h后，于4℃、12 000 r/min离心30 min，弃上清，以上步骤重复2次，收集沉淀。

1.2.1.3 BPP抽提法

略微改进Wang等[19]的方法。取1.0 g海南油茶种仁粉末，加入10 mL BPP 蛋白提取液(EDTA 100 mmol/L, VC50 mmol/L, 三羟甲基氨基甲烷10 mmol/L, 四硼酸钠50 mmol/L, 1.0% PVPP, 1.0% Triton X-100, 2.0% BME, 30%蔗糖, pH 8.0)，在室温下涡旋混匀10 min，于4℃、12 000 r/min离心15 min，将上层BPP相转移至新的50 mL离心管中，此步骤重复2次，合并BPP提取层，并加入等体积Tris饱和酚，室温涡旋振荡10 min，离心(4℃、12 000 r/min)15 min后，转移上层酚相至另一新离心管中，再加入等体积BPP蛋白提取液，室温涡旋10 min，于4℃、12 000 r/min离心20 min，然后小心吸取上清液与5倍体积预冷的过饱和硫酸铵甲醇溶液充分混匀，-20℃静置过夜后，悬浮液离心(4℃、12 000 r/min)15 min，弃上清，收集沉淀。

1.2.2 蛋白裂解液的制备

将提取的油茶种仁蛋白沉淀用预冷甲醇清洗2次，随后用预冷丙酮清洗2次，弃上清，室温下自然风干后，加入样品裂解液(尿素7.0 mol/L, 硫脲2.0 mol/L, DTT 13 mmol/L, 2.0% CHAPS)，22℃恒温裂解2 h以上，于4℃、12 000 r/min离心30 min，转移上清液即蛋白裂解液至1.5 mL离心管中，-20℃保存备用。

1.2.3 蛋白质得率测定

蛋白定量采用Bradford[20]方法，通过紫外分光光度计在波长595 nm处测定吸光值，每个材料重复3次，以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，BSA质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到TCA-丙酮沉淀法和BPP抽提法标准曲线方程分别为y=0.058 5x+0.013 2(R2=0.999 9)和y=0.05 42x+0.048 1(R2=0.999 9)。测定油茶种仁蛋白裂解液595 nm处的吸光值，代入标准曲线方程中，计算蛋白质质量浓度。按下式计算蛋白质得率。

蛋白质得率=蛋白质质量浓度×蛋白裂解液体积/油茶种仁质量

1.2.4 蛋白质单向SDS-PAGE[21]

根据蛋白定量结果确定相应上样量(30 μg)，配制成总体积为25 μL的上样体系(Loading buffer, 蛋白裂解液)，循环水浴保持16℃，电泳参数设置为6 W/gel、1 h和8 W/gel、5 h，待指示线迁移至距胶底部约1.0 cm处时，停止电泳。

1.2.5 蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)

1.2.5.1 蛋白水化上样

根据蛋白定量结果确定其上样量(1 300 μg)，配制成总体积为455 μL的上样体系(DTT, IPG buffer, 蛋白裂解液)，充分混匀后加入水化盘中，缓慢放置IPG胶条，于22℃恒温水化18 h以上，待胶条完全吸收水化液即可。

1.2.5.2 第一向等电聚焦(IEF)

开机自检后，待等电聚焦仪面板温度冷却至20℃时准备聚焦，环境温度保持20℃，每根胶条限流50 μA，最高电压限制10 000 V，程序设置如下：Constant, 250 V, 3 h；Constant, 500 V, 2 h；Constant, 1 000 V, 1 h；Gradate, 8 000 V, 3 h；Constant, 8 000 V, 110 000 Vh；Constant, 1 000 V, 18 h。

1.2.5.3 IPG胶条平衡

第一向等电聚焦结束后，胶条依次在含有1.0% DTT的平衡缓冲液(尿素6.0 mol/L, 三羟甲基氨基甲烷50 mmol/L, 2.0% SDS, 0.002% BPB, 30%甘油, pH 8.8)和含有4.0% IAM的平衡缓冲液中进行平衡，每次分别在平衡槽内平衡15 min。

1.2.5.4 第二向SDS-PAGE

平衡结束后，转移胶条水平放置于12.5% SDS-PAGE凝胶的上端，用含有溴酚蓝的1.0%琼脂糖封固胶条，在Ettan DAL Tsix垂直电泳仪中进行电泳，循环水浴保持16℃，电泳参数设置为6 W/gel、1 h和8 W/gel、5 h，待指示线迁移至距胶底部约1.0 cm处时，结束电泳。

1.2.6 凝胶染色及图像采集分析

电泳结束后，采用考马斯亮蓝染色液进行染色[22]，再小心取出凝胶，用脱色液清洗直至背景清晰为止。脱色完全后通过Image Scanner Ⅲ型投射扫描仪对凝胶进行图像扫描，参数设置为：投射扫描，灰度阶256，分辨率300 dpi，TIF格式保存。然后用Image Master 2D Platinum 5.0软件进行凝胶图像数据分析。

1.2.7 蛋白质胶内酶解

从凝胶上挖取目标蛋白点放至PCR薄壁管中，并用100 μL去离子水清洗3次，摇床振荡30 min；除去水，加入100 μL脱色液(碳酸氢铵50 mmol/L, 50%乙腈)脱色30 min，直至胶粒完全变为透明为止；除去脱色液，再加入80 μL乙腈，室温脱水20 min；除去乙腈，将胶粒放置在超净工作台中微风干燥1 h；随后加入3.0 μL胰蛋白酶工作液(20 ng/μL)，使酶液完全浸入胶粒，于4℃条件下静置1 h，再吸去多余酶液，并加入5.0 μL酶缓冲液(氯化钙0.5 mmol/L, 碳酸氢铵50 mmol/L, pH 8.0～8.5)，37℃恒温酶解约16 h；待酶解完成后，室温、12 000 r/min条件下离心5 min，吸取上清液进行质谱分析[23]。

1.2.8 蛋白质谱鉴定

采用5800 MALDI-TOF MS/MS型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对酶解得到的肽段混合物进行质谱鉴定，经基质峰、酶自切峰校正，根据海南油茶种仁转录组测序结果进行蛋白预测，并建立数据库，然后通过Mascot Distiller软件分析质谱数据，当匹配值小于0.05，且检索分数超过标准线时，认为该蛋白被成功鉴定，得分越高，其可信度越高。质谱条件：基质辅助激光解吸电离源；扫描方式一级质谱全扫描(MS)，二级质谱全扫描(MS/MS)；扫描范围为m/z1 000～4 000；激光强度为3 700；多肽及多肽碎片的碎裂方式为碰撞诱导电离(HCD)。

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法对海南油茶种仁蛋白提取效率的影响

为探究不同方法之间蛋白提取效率的差异，在油茶种仁鲜重均为1.0 g的条件下，对采用2种提取方法所得样品蛋白的质量浓度和得率进行比较分析，结果见表1。

表1 不同提取方法对海南油茶种仁蛋白提取效率的影响

由表1可知，相对于TCA-丙酮沉淀法，BPP抽提法所得油茶种仁蛋白具有较高的质量浓度和得率，分别为12.704 μg/μL 和5.082 mg/g，故判断此方法提取海南油茶种仁蛋白效果良好。

2.2 不同方法提取的蛋白单向SDS-PAGE图谱比较分析

分别对采用2种提取方法所得的海南油茶种仁蛋白进行SDS-PAGE分析，结果见图1。

注：M.Protein Marker；A.TCA-丙酮沉淀法；B.BPP抽提法。

图1 不同方法提取的海南油茶种仁蛋白的单向SDS-PAGE图谱

由图1可知，二者的蛋白条带都主要集中在18.4～66.2 kDa范围之间，且在18.4、25、45 kDa附近均出现3条明显的高丰度蛋白条带，但彼此分离后的条带数目、位置及丰度值却存在显著差异。采用BPP抽提法所得蛋白条带分离均匀，背景清晰，高丰度蛋白条带相对集中，提取效果较好；而TCA-丙酮沉淀法所得蛋白条带数相对较少，蛋白质缺失严重，轮廓模糊，在相对分子质量小于18.4 kDa处出现弥散现象，故判断BPP抽提法优于TCA-丙酮沉淀法。

2.3 不同方法提取的蛋白2-DE图谱比较分析

分别对采用2种方法所提取的海南油茶种仁蛋白进行2-DE分析，结果见图2。

由图2可知，蛋白提取方法对2-DE结果影响较大，BPP抽提法所得蛋白的2-DE图谱背景干净，蛋白点分散均匀、分离充分、数量较多、轮廓清晰、形状规则呈圆形或近圆形，基本无明显拖尾现象，经Image Master 2D Platinum 5.0软件分析后，在凝胶图上共检测出847个蛋白点，集中分布在等电点(pI)pH 5.0～6.0、相对分子质量(Mr)86～42 kDa范围内，而在偏酸性端pH 4.0～4.5以及高相对分子质量(>102 kDa)区域内几乎没有蛋白点，虽存在少量蛋白堆积现象，但整体聚焦效果较好。对于TCA-丙酮沉淀法所得蛋白的2-DE图谱，蛋白点数较少(662个)，分辨率较低，形状不圆润，无大量高丰度蛋白，且出现不同程度的横向条纹。综合分析2种提取方法所得蛋白的2-DE图谱，认为BPP抽提法具有更好的提取率，不会造成蛋白质大量损失，更适于油茶等油料作物种仁蛋白的提取及2-DE等分析研究。

注： A.TCA-丙酮沉淀法；B.BPP抽提法。

2.4 质谱鉴定

为了确定BPP抽提法所得海南油茶种仁蛋白的质谱兼容性，从2-DE凝胶上选取了12个高分辨率蛋白点进行质谱鉴定(图3)，质谱鉴定信息见表2。

注：箭头所示的点为选取进行质谱鉴定的蛋白点。

由表2可知，有10个蛋白点被成功鉴定，鉴定成功率为83.3%，数据库搜库得分均超过100，且序列覆盖率可达14%～25%，说明酶解产物中包含较多的目标蛋白肽段序列，该鉴定结果相对可靠。其中，蛋白点1为蛋白二硫键异构酶(PDI)，蛋白点2为Rubisco亚基结合蛋白(RBP)，蛋白点3为热激蛋白70(Hsp70)，蛋白点4为伴侣蛋白60(CPN60-2)，蛋白点5为焦磷酸化酶(PPase)，蛋白点6为尿黑酸1, 2-双氧化酶(HGD)，蛋白点7为丝氨酸蛋白酶(EDA2)，蛋白点8为球蛋白(GBP)，蛋白点10为ATP合酶β亚基(ATPaseβ)，蛋白点12为乙醛脱氢酶(ALDH2B4)。这些蛋白质主要参与氨基酸代谢、脂类代谢、碳水化合物运输与代谢、能源生产与转化等生物过程，还可作为分子伴侣在蛋白翻译后修饰方面发挥重要作用。

表2 海南油茶种仁蛋白点的质谱鉴定信息

续表2

蛋白点蛋白名称Unigene号蛋白点得分等电点/相对分子质量总(匹配)肽段数序列覆盖率/%物种07丝氨酸蛋白酶 (Probable serine protease EDA2)Unigene0721843575.85/49.525 (5)16Juglans regia08球蛋白 (Globulin-like pro-tein)Unigene0638903515.94/52.805 (5)21Actinidia chinensis10ATP合酶β亚基 (ATP synthase subunit beta, mito-chondrial-like)Unigene0718594936.06/59.597 (7)18Solanum lycopersicum12乙醛脱氢酶 (Aldehyde de-hydrogenase family 2 mem-ber B4, mitochondrial-like)Unigene0872282246.44/58.875 (5)14Ziziphus jujuba

注：蛋白点代表图3中标记的蛋白点号；Unigene号代表油茶种仁转录组测序鉴定所得基因号；蛋白点得分代表检索Mascot Distiller软件所得计算分数; 蛋白点9和蛋白点11未经质谱鉴定成功(蛋白得分低于标准线)；总(匹配)肽段数括号内数值代表总肽段数中可信值大于95%的肽段数。

2.5 讨论

蛋白样品制备是蛋白质组学研究的首要前提，其质量是决定后续单向SDS-PAGE及2-DE结果的关键因素。目前为止，尚未发现一种适用于所有植物蛋白的提取方法，因为不同植物组织或细胞内部的次生代谢产物存在差异，这些物质会与蛋白结合形成各种能破坏其结构的复合物，从而不同程度地干扰后续蛋白的分离与鉴定，故针对不同植物材料，选择合适的蛋白提取方法尤为重要[23]。曹锐等[24]发现新型TCA-丙酮法适用于莲子叶和胚芽组织的蛋白质提取，而传统TCA-丙酮法则适用于提取莲的胚轴组织蛋白。邱智敏等[17]研究表明采用TCA-丙酮结合酚抽法提取油茶雌蕊蛋白能够得到更多较为清晰的蛋白点。油茶属于油料作物，其种仁中富含油脂、多酚、多糖等会与蛋白发生共沉淀的代谢产物，从而难以获得无污染、无缺失的高质量植物蛋白，严重影响等电聚焦效果和电泳图谱的分辨率[25]。

为寻找适合于油茶种仁蛋白的提取方法，本研究进行了TCA-丙酮沉淀法和BPP抽提法的对比试验，结果发现BPP抽提法所得凝胶图谱背景清晰，蛋白点数量较多(847个)，形状基本规则，无明显拖尾现象，而TCA-丙酮沉淀法所得蛋白点数较少(662个)，分离不充分，无大量高丰度蛋白，且出现了不同程度的横向条纹及弥散现象，故认为BPP抽提法能够有效防止蛋白变性，减少蛋白降解以及避免蛋白修饰，且可降低样品中脂类、盐类及糖类等对蛋白分离和鉴定造成的干扰，使结果具有良好的重复性[15]。占志勇等[16]研究发现TCA-丙酮法会损失大量油桐种仁蛋白，而酚抽法则适用于富含抑制电泳复合物的顽拗性植物组织蛋白提取，与本试验结果一致。吴波等[26]对传统TCA-丙酮法进行改进，显著提高了油茶种仁蛋白(816个)的提取数量，但其2-DE图谱上却出现了许多较为明显的纵向条纹。何艺凡等[27]认为采用TCA-丙酮结合酚抽法(聚焦条件62 000 V·h，凝胶浓度10% SDS)提取油茶种仁蛋白的分离效果较好，虽与本研究的提取优化方法以及电泳体系条件存在差异，但二者所得图谱的高丰度蛋白点分布却基本一致，说明尽管不同方法对同一植物材料的适用性不同，若根据植物自身因素来改良制备技术仍可获得大量的优质蛋白[28]，如在提取液中加入Triton X-100、PVPP、BME等，能够有效抑制蛋白酶活性，防止多酚等物质发生氧化，进而保证蛋白的得率与质量[29-30]。

从BPP抽提法所得的2-DE凝胶上选取12个高丰度蛋白点进行质谱鉴定，成功率高达83.3%，表明该方法所得蛋白具有良好的质谱兼容性。其中，蛋白二硫键异构酶(蛋白点1)具有独特的底物特异性、伴侣活性及氧化还原性等重要生物功能，可促进和催化蛋白内或蛋白间形成正确的二硫键[31]；热激蛋白70(蛋白点3)属于进化高度保守的蛋白超家族成员，通常作为分子伴侣参与蛋白多肽链的转运、降解和组装以及免疫识别、细胞凋亡等生理过程，由应激诱导产生，通过对受损蛋白进行修复而保护机体免受伤害[32]；伴侣蛋白60(蛋白点4)是一类存在于线粒体中的寡聚蛋白复合体，能利用ATP水解帮助新合成或未成熟的多肽完成折叠装配，同时在受体信号转导及细胞凋亡等过程中发挥重要作用[33]；球蛋白(蛋白点8)是双子叶植物贮藏蛋白的主要类型，负责提供种子萌发和生长所需的大部分营养物质[34]；乙醛脱氢酶(蛋白点12)通过利用NAD(P)+能将许多内源依赖性酶、脂肪族和芳香族醛氧化成羧酸，是乙醇代谢途径中最关键的酶，同时还具有响应环境胁迫和病原菌侵染的抗逆特性[35]。基于上述结果，判断本研究所优化的BPP抽提法，以及进行的油茶种仁蛋白单向SDS-PAGE和2-DE图谱效果较好，质谱鉴定技术兼容性较高，能满足后续蛋白质组学分析的试验要求。

3 结 论

本研究以海南油茶成熟种仁为试验材料，从蛋白质提取方法的筛选与优化入手，比较不同方法对该植物种仁蛋白提取效率的影响，同时结合单向SDS-PAGE和2-DE技术、质谱鉴定手段和Mascot Distiller软件进行分析。结果显示，相对于TCA-丙酮沉淀法，改良后的BPP抽提法对油茶种仁蛋白的提取得率更高，其图谱背景清晰，蛋白点数量较多(847个)，形状圆润规则，整体分布均匀，高丰度蛋白相对集中，基本无明显拖尾现象，说明此样品制备方法具有稳定高效等特点，更适用于油茶种仁蛋白的提取及单向、双向电泳等的凝胶成像分析。此外，对该植物种仁蛋白进行双向电泳结合质谱检测手段的初步探索，选取12个高分辨率的蛋白点，经质谱成功鉴定了10个，分别代表10种蛋白质，鉴定成功率达83.3%。该方法可为后续深入开展油茶蛋白质组学研究奠定技术基础，同时也为其他油料作物种仁蛋白的分离鉴定提供科学依据。