用于肿瘤治疗的线粒体靶向配体和纳米载体递释系统研究进展

刘云虎 孙 涛

(复旦大学 药学院，上海 201203)

0 引言

线粒体作为活细胞中的“能量工厂”，通过三羧酸循环、氧化磷酸化和电子传递等过程产生ATP. 同时，线粒体也介导细胞中许多重要的信号通路.在能量缺乏、氧化应激或其他条件下，线粒体通过释放细胞色素C介导细胞凋亡信号通路.细胞色素C通过膜电位的降低、线粒体通透性转换孔道的开放等方式被释放到细胞质，随后与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前体蛋白形成凋亡小体并激活半胱天冬酶-9.被激活的半胱天冬酶-9能继而激活半胱天冬酶-3等其他半胱天冬酶，引发细胞凋亡[1].由于对细胞产能和凋亡有重要调控作用，线粒体成为肿瘤治疗的重要靶点[2].

相对于正常细胞，癌细胞的线粒体结构和功能存在一些变化，例如线粒体跨膜电位相对正常细胞有所增加、线粒体三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)生成能力受损和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成异常增加等.因此，对于一些作用于直接与线粒体相互作用或通过影响线粒体功能以改变细胞代谢的药物，这些差异的存在可能为其提供了优先靶向肿瘤细胞的生物学基础[2].例如线粒体跨膜电位的增加使一些线粒体靶向化合物能够优先累积在癌细胞线粒体；由于ATP与ROS的异常生成，癌细胞线粒体更容易发生功能障碍和线粒体DNA突变，这使得部分作用于线粒体的抗癌药物对可能对癌细胞具有更大的杀伤性等等.所以药物的线粒体靶向递送可能对增强其对肿瘤细胞的选择性具有一定价值.此外，已知许多抗癌药物(阿霉素、顺铂、紫杉醇、白藜芦醇和卟啉衍生物等)可在线粒体被激活[3].因此，增强抗癌药物在线粒体的靶向积累将有助于提高治疗效果，并有可能克服耐药性问题.综上所述，将抗癌药物的线粒体靶向递送策略具有较高的研究价值.

目前实现药物的线粒体靶向递送主要有两种方法：用线粒体靶向配体与药物直接缀合，或是通过具有线粒体靶向功能的纳米载体进行药物递送.分别对用于抗癌药物缀合的线粒体靶向配体和用于线粒体靶向递药的纳米载体的研究现状进行了综述.

1 用于肿瘤治疗的线粒体靶向配体

将线粒体靶向配体与药物直接缀合是实现药物的线粒体靶向递送的一种思路.其中常用的线粒体靶向配体包括三苯基膦(Triphenyl phosphonium, TPP)、地喹氯铵(Dequalinium, DQA)、F16、胍盐、罗丹明19、罗丹明123、线粒体穿透肽(Mitochondrial penetrating peptide, MPPs)等等.它们中的大多数都是离域亲脂性阳离子(Delocalization lipophilic cation, DLCs)，这些配体的脂溶性使其能够穿过细胞膜和线粒体膜，同时其所带的正电荷使其在线粒体膜电位作用下进入线粒体基质，使其具有线粒体靶向效应.又因癌细胞和转化细胞的线粒体比正常细胞具有更高的跨膜电位，离域亲脂性阳离子可优先在癌细胞线粒体中积累[3].

线粒体靶向配体与药物直接缀合的优点是能使药物更加精准地靶向递送至线粒体.但线粒体靶向配体-药物缀合物一般具有水溶性不佳的问题，且一些线粒体靶向配体具有细胞毒性.线粒体靶向配体直接与药物缀合还有可能会影响药物的化学活性[3].

1.1 三苯基膦(Triphenylphosphonium, TPP)

三苯基膦是应用最广泛的线粒体靶向亲脂性阳离子配体，它由一个带正电荷的磷离子和三个苯环连接而成，后者使其具有较大的脂溶性.三苯基膦曾经用于线粒体膜电位的测量，其行为和与线粒体的相互作用已经非常明确[4].膜电位每升高60 mV，TPP在膜负电位侧的相对浓度就增加10倍.细胞质膜的膜电位通常在-60至-30 mV之间，这使细胞内外TPP浓差达10倍；线粒体膜电位则一般低至-180 mV，这又使线粒体内TPP累积高达1000倍.TPP作为线粒体靶向配体，相对于其他小分子线粒体递送方法具有如下优势：TPP在生物系统中较稳定，兼具亲水性和亲脂性，合成与纯化相对简单，对细胞组分的化学反应性低，且在可见光和近红外光谱区域中无光吸收或荧光发射[5].下面对一些使用TPP作为为线粒体靶向配体与抗癌药物缀合的实例进行了介绍.

Fan及其团队设计并合成了线粒体靶向前体PDT-PAO-TPP[6]. PDT-PAO是一种有机砷(图2)，其对白血病、淋巴瘤和实体瘤有一定抗癌功效[7].将之与TPP缀合，在细胞毒筛选中，相对PDT-PAO，PDT-PAO-TPP显示出对NB4细胞更好的抑制能力.PDT-PAO对NB4细胞的半抑制浓度(IC50)为1.25±0.02(24 h)和0.82±0.15(48 h)，而PDT-PAO-TPP对NB4细胞的IC50为0.65±0.05(24 h)和0.51±0.01(48 h)，低于PDT-PAO.研究证实大部分PDT-PAO-TPP在线粒体中积累，并可诱导线粒体去极化.此外，PDT-PAO-TPP对丙酮酸脱氢酶复合物(PDHC)和呼吸链复合物具有双重抑制作用，能介导细胞色素C的释放和激活胱天蛋白酶依赖性ROS介导的细胞凋亡.另外，Zhu Z Z及其团队用-CH2Ph3P+修饰Pyriplatin设计了三种单功能线粒体靶向的PtII复合物OPT，MPT和PPT.(图3)[8]单官能PtII复合物Pyriplatin此前

被报道具有抗肿瘤活性[9].进一步研究证明这三种复合物均可穿透线粒体并在线粒体基质中积累.其中OPT对小鼠A549肺癌细胞具有最高的细胞毒性，在相同条件下，OPT对A549细胞处理48 h的IC50为8.7 ± 1.6,远远低于Pyriplatin(125.5 ± 5.8)，且低于顺铂(12.6 ± 1.1).

对肺癌异种移植瘤小鼠，OPT注射19 d后，肿瘤体积增长低于注射生理盐水或顺铂的对照组.研究其在小鼠中的组织分布发现，相比正常肺组织，OPT在肿瘤组织中的积累量提高近1.5倍，而顺铂则不具有该肿瘤组织靶向性.

1.2 地喹氯铵(Dequalinium，DQA)

地喹氯铵由两个阳离子喹啉基团经10个碳的烷基链连接而成，是一种离域的亲脂性阳离子分子，具有线粒体靶向定位效应.该化合物在体外能够抑制多种癌细胞系的增殖，在体内亦具有抗肿瘤活性[10,11].研究表明其能诱导ROS的产生、抑制ATP的合成，导致线粒体膜电位的下降，造成细胞色素C的释放，激活半胱天冬酶-9/半胱天冬酶-3依赖性的内源性细胞凋亡途径[12].部分研究使用了地喹氯铵与抗肿瘤药物多柔比星(Doxorubicin, DOX)的缀合物DQA-Dox以实现多柔比星的线粒体靶向递送，其在MCF-7/ADR细胞中主要积累在线粒体，且对MCF-7/ADR展现出高细胞毒性[13].

1.3 (E)-4-(1H-吲哚-3-基乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物(F16)

F16作为一种离域亲脂性阳离子配体，具有线粒体靶向定位效应.它最初通过细胞水平的高通量筛选被发现，这种小分子能够选择性抑制乳腺上皮细胞，神经过度表达细胞以及多种小鼠乳腺肿瘤和人乳腺癌细胞系的增殖[14]. F16本身具有细胞毒性，其在线粒体的累积会引起线粒体膜的去极化，破坏线粒体结构的完整性，导致线粒体通透性转换孔道的开放，随后造成细胞色素C的释放，促使细胞凋亡[14].将其作为线粒体靶向配体的实例包括He H及其团队所报道的研究[15].该研究将F16和广泛使用的硼二吡咯亚甲基荧光染料(Boron-dipyrromethene, BODIPY)通过苯乙炔基接头进行结合，制成了具有光学监测能力和选择性抗癌活性的双功能线粒体靶向抗癌剂FPB(图6).细胞毒筛选显示，FPB对SGC-7901细胞的IC50比其不含BODIPY的前体F16-Ph-Ace低5倍，这说明硼二吡咯甲烷(游离形态时无明显毒性)可能在FPB对细胞毒性起特殊作用.

1.4 胍/双胍(Guanidine/Biguanidine)

胍和双胍都是离域亲脂性阳离子配体，其具有离域正电荷，因此比带有定域电荷的基团表现出更强的亲脂性.有研究指出基于两亲性阳离子喹啉的光敏剂与胍和双胍单位缀合能够提高其线粒体靶向定位效果与光毒性[16].该研究亦指出胍基团的存在可使胍-卟啉结合物发生溶酶体逃逸，其机制可能为质子海绵效应引起的溶酶体膜破裂[16].

1.5 罗丹明(Rhodamine)

罗丹明123作为一种荧光染料曾被用于测量线粒体膜电位[17].因为具有亲脂性和阳离子特性，它能在线粒体膜电位的驱动下穿过线粒体内膜，并在线粒体基质中积累.罗丹明123在动物肿瘤模型中表现出选择性抗癌活性，这种选择性的细胞毒性还可通过联用2-脱氧葡萄糖或甲基乙二醛双脒基腙进一步增强[18-20].但在相关临床实验中，罗丹明123的最大耐受剂量较低，而被认为无法满足治疗的需求[21].

与罗丹明123类似的罗丹明19被认为是一个潜在的线粒体靶向定位基团.用罗丹明19取代TPP-药物缀合物上的TPP，新的缀合物表现良好的线粒体靶向定位性，证明罗丹明19具有良好的线粒体定位能力[22].

1.6 线粒体穿透肽(Mitochondria-penetrating peptide，MPPs)

线粒体穿透肽是一般具有重复的亲脂残基和阳离子残基的、具有线粒体通透性的短肽，例如(L-环己基丙氨酸-D-精氨酸)3，即(Fx,r)3，其由重复的亲脂残基环己基丙氨酸和阳离子残基精氨酸构成.线粒体膜电位驱动摄取是该线粒体穿透肽的主要线粒体导向机制.线粒体穿透肽作为线粒体靶向辅基具有合成简单、衍生物容易制备及生物相容性好等优点[23].在针对其与多柔比星(Doxorubicin,Dox)缀合形成的肽-Dox缀合物(mtDox)的研究中，发现相对游离Dox，mtDox在A2780ADR耐药细胞中显示出更强的活性[24].该研究指出其机制可能与mtDox的线粒体靶向性，以及P-gp转运蛋白结合位点的阻断有关.但在药物敏感细胞中，mtDox的细胞毒性低于游离Dox.

1.7 线粒体靶向序列(Mitochondria-targeting sequence,MTSs)

由于绝大多数线粒体蛋白的前体蛋白合成于胞浆核糖体，因此这些前体蛋白需要有能被线粒体表面受体识别的特定线粒体靶向信号序列，以完成线粒体靶向.这些序列一般具有20-40个氨基酸的长度.此前，MTSs已被成功应用于一系列生物大分子的线粒体靶向递送，包括DNA和蛋白质等[25,26]. Wang等将编码线粒体基质酶鸟氨酸氨甲酰化酶(OTC)前导肽的线粒体靶向序列(LFNLRILLNN AAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNK)与来源于腺病毒的受体调节细胞内吞作用信号(CKKKKKKSEDEYPYVPN)连接，再以其修饰3-氨基丙基三乙氧基硅烷改性磁性纳米粒子，以期通过纳米粒子的线粒体靶向来改善肿瘤纳米热疗的治疗效果[27].实验结果表明，相对仅修饰受体调节细胞内吞作用信号的磁性纳米粒子(经纳米热疗后HepG2细胞存活率72.35 ± 5.04%)，修饰了受体调节细胞内吞作用信号和线粒体靶向序列的磁性纳米粒子细胞毒性明显提升(HepG2细胞存活率53.23 ± 4.48%).

2 用于肿瘤治疗的线粒体靶向纳米载体

虽然将线粒体靶向配体与抗癌药物直接缀合的策略起到了良好的线粒体定位效果，但这些缀合物在水溶性和生物相容性方面的缺陷使其距离临床应用还有一定距离.相比之下，使用纳米载体装载抗癌药物的策略具有生物相容性好，调节药物药代动力学特征，提高药物化学稳定性等优点，一些纳米载体还可以控制其运载药物在特定的靶点进行释放[28].纳米载体可以通过与靶向配体相连接实现线粒体靶向，少数纳米载体因为自身的特性而本身具有线粒体靶向能力.用于肿瘤治疗的纳米载体包括纳米颗粒、脂质体、胶束、树状大分子、碳纳米颗粒和金属纳米颗粒等.下面将分类进行讨论.

2.1 聚合物纳米颗粒与胶束

聚合物纳米颗粒由两亲聚合物组装而成，一般可在体内生物降解.其具有生物相容性高，体积小，载药量高，水溶性好，毒性低，且易于进行修饰等优点.一些聚合物纳米颗粒与胶束已经应用于线粒体靶向，包括聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)、聚己内酯(Polycaprolactone, PCL)、壳聚糖、透明质酸、树枝状高分子和一些由小两亲分子形成的胶束等.下面介绍一些用于线粒体靶向药物递送聚合物纳米颗粒与胶束的实例.

Cho及其团队报道了一种将三苯基膦连接在低分子量聚己内酯(Polycaprolactone, PCL)聚合物两端而制成的两亲多聚物TPP-PCL-TPP(TPCL)[29].该多聚物在水性介质中自组装形成TPCL纳米颗粒，该纳米颗粒由于本身表面所带的正电荷可能具有一定的细胞毒性.同时该纳米颗粒的平均直径为100 nm，为合适的药物载体尺寸.疏水的多柔比星和亲水的盐酸多柔比星皆可被装载在该种纳米颗粒中.研究观察到了对比游离多柔比星，TPCL纳米颗粒具有更佳的线粒体靶向能力，并使多柔比星的细胞毒性升高了3-5倍.

Liu及其团队将氯尼达明(Lonidamine, LND)与TPP缀合，再将所得共聚物TPP-LND与Dox组装以形成TPP-LND-Dox纳米颗粒，最后用甲氧基聚乙二醇羧酸(mPEG-COOH)修饰其表面，使其表面呈电中性，以提高其稳定性[30].该纳米颗粒不仅具有较高的载药量，还有TPP提供的良好的线粒体靶向性，LND和Dox协同抗癌作用.该纳米颗粒与Dox耐药的MCF-7/ADR细胞孵育48h之后，细胞存活率低至22.3%，而不具线粒体靶向功能的Dox纳米颗粒以及TPP-LND纳米颗粒相同条件下细胞存活率分别为60.2%和47.6%.在BALB/c裸鼠上构建的MCF-7/ADR肿瘤模型中，两周后相对于PBS缓冲液对照组(肿瘤体积增大9.11 ± 0.56倍)，TPP-LND-Dox纳米颗粒组肿瘤体积增加仅增加2.17 ± 0.23倍，低于Dox纳米颗粒(6.92 ± 0.36倍)和TPP-LND纳米颗粒(5.34 ± 0.41倍).

Liu H N等将Dox-TPP和透明质酸(Hyaluronic acid, HA)以可裂解的腙键(Hydrazone bond)缀合，制成了HA-hydra-Dox-TPP多聚物.[31]该多聚物自组装形成纳米颗粒，亲水端HA为壳，疏水端TPP为核；其中pH敏感的腙键在肿瘤组织微酸性环境下会裂解，从而实现肿瘤内药物释放.透明质酸在该纳米颗粒上作为靶向肿瘤细胞的靶头.腙键在细胞内溶酶体中被完全水解，从而释放出线粒体靶向分子Dox-TPP.该纳米颗粒具有良好的生物相容性和肿瘤靶向能力，并显示出对MCF7/ADR细胞更高的细胞毒性(86 μM浓度时细胞存活率约为游离Dox对照组的一半).而体内研究表明，裸鼠上的MCF-7/ADR肿瘤给药18 d后体积增长2.15倍，低于给游离Dox的对照组(肿瘤体积增长3.62倍)，且游离Dox对照组裸鼠出现严重心、肝损伤，而给纳米颗粒组裸鼠的则未出现.这说明通过该纳米颗粒靶向递释Dox比游离Dox对耐药肿瘤具有更高的安全性和抗肿瘤功效.

Tan及其团队将(4-羧基丁基)三苯基溴化鏻( (4-Carboxybutyl) triphenylphosphonium bromide, CTPP)与糖脂样缀合物(Glucolipid-like conjugates, CSOSA)经NH2-PEG2000-NH2缀合，将所得缀合物装载疏水弱酸性药物雷公藤红素 (Celastrol, Cela)制成平均尺寸为63.5 ± 18.0 nm的CTPP-CSOSA/Cela胶束[32].疏水弱酸性的雷公藤红素在线粒体内弱碱性环境中溶解度加大，导致雷公藤红素与胶束疏水核心之间的相互作用减弱，以此实现线粒体内碱性pH响应的药物释放，减少细胞质和溶酶体中的药物渗漏.相对游离雷公藤红素，该胶束具有相对更好的肿瘤靶向性，更高的抗肿瘤效力和相对较低的全身毒性.

Han K及其团队将光敏剂原卟啉IX(Protoporphyrin IX, PpIX)与聚乙二醇-促凋亡肽(KLAKLAK)2相缀合，获得平均尺寸91 nm的自组装的纳米胶束[33].在短时间光照射下，光敏剂的光化学内化(Photochemical Internalization, PCI)效应使该纳米胶束能获得更理想的细胞递送，而促凋亡肽(KLAKLAK)2可启动肿瘤细胞凋亡过程并提供线粒体靶向能力.该纳米胶束可作为线粒体靶向的光动力剂，在长时间光照下原卟啉IX与促凋亡肽协同作用诱导ROS的产生，介导细胞色素C的释放和细胞凋亡.因此采用短时加长时照射的双阶段光照策略进行光动力治疗，荷瘤小鼠的肿瘤质量下降比例约为游离PpIX的3倍，(KLAKLAK)2的2倍.

2.2 DQAsomes和DQA-脂质体

DQA具有两亲性，其在水性介质中聚集而成的直径70至700 nm的囊泡状聚集体被称作DQAsomes.DQAsomes被广泛运用作载体向线粒体递送DNA和细胞毒性药物.DQA作为线粒体靶向配体，因其破坏线粒体膜电位、诱导ROS产生和抑制ATP合成的活性而具有对癌细胞有一定选择性的细胞毒性[34].但由于DQAsomes的内体逃逸能力和转染效率较低，其在转染和线粒体靶向递释药物方面的潜力受到限制[35].但随着研究的进一步发展，更多性能优秀的基于DQA-脂质体的线粒体靶向载体被发现.

Bae及其团队利用1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phoshphoethanolamine, DOPE)和DQA按10:10:80的比例制备了一种DQA80s脂质体，该脂质体具有作为线粒体靶向载体和线粒体靶向抗癌药物的双重潜力[35]. DQA80s具有出比DQAsomes更大的细胞毒性；与DQAsomes相比，DQA80s的细胞摄取显著增加，并且具有更好的溶酶体逃逸能力.与载体DQAsome相比，DQA80s在HeLa细胞和真皮成纤维细胞中显示了更高的转染效率.

Yu 等人将抗癌药物托泊替康盐酸盐装载到由聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS1000)和DQA制成的脂质体中[36].作为P-gp抑制剂，TPGS1000可抑制耐药癌细胞中P-gp转运蛋白的表达.装载托泊替康的脂质体在MCF7和MCF7/ADR细胞中的细胞毒性相对游离托泊替康分别高出2倍和4倍.通过共聚焦激光扫描显微图像发现该脂质体能将荧光探针香豆素-6靶向递送到线粒体，该组在线粒体中的荧光信号强度比对照组(游离香豆素-6和用非靶向脂质体递送香豆素-6)分别提高至21.2倍和12.9倍.通过Cy7进行荧光标记的脂质体在MCF7/ADR荷瘤小鼠的肿瘤区域有最强的荧光信号，说明该脂质体具有良好的肿瘤靶向性；体外细胞毒筛选结果显示，靶向线粒体的托泊替康脂质体对MCF-7和MCF-7/ADR细胞都具有最强的杀伤性.应用游离拓扑替康、负载拓扑替康脂质体和线粒体靶向负载拓扑替康脂质体后，MCF-7细胞的诱导凋亡百分比分别为19.7%、15.8%和33.5%;MCF-7/ADR细胞分别为10.4%、13.6%和24.0%.体内抗肿瘤研究中，相对游离拓扑替康、负载拓扑替康脂质体，线粒体靶向负载拓扑替康脂质体表现出最好的抑制肿瘤生长的效果.与之类似的，Zhou等将抗癌药物紫杉醇装载在TPGS1000和DQA制成的脂质体中，与游离紫杉醇和常规紫杉醇脂质体相比，该靶向紫杉醇脂质体在体外和抗药性A549/cDDP异种移植肿瘤模型均表现出最强的抗癌功效[37].

Wang及其团队利用地喹氯铵-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DQA-PEG2000-DSPE)制成的线粒体靶向脂质体装载白藜芦醇，以期改善白藜芦醇水溶性低、稳定性差等缺点[38].装载了白藜芦醇的线粒体靶向白藜芦醇脂质体粒度约为70 nm，具有较高的包封效率(>95%).该脂质体能靶向性积累于线粒体，A549细胞中线粒体内积累量约提高至约2.65倍，A549/cDDP细胞中线粒体内提高至约4.7倍；相对于游离白藜芦醇，该线粒体靶向白藜芦醇脂质体诱导A549细胞凋亡率提高至2.84倍(72.63 ± 0.59% / 25.59 ± 6.28%)，诱导A549/cDDP细胞凋亡率提高至1.46倍(38.14 ± 0.74% / 26.17 ± 0.29%).

2.3 无机纳米粒子载体

许多研究报道了用于药物递送，成像和治疗目的的无机纳米粒子载体，这些无机纳米粒子载体相对有机纳米粒子载体而言具有生物相容性好、稳定性好、毒性低、亲水性佳等优势[39].近期开发的用于抗癌治疗的线粒体靶向无机纳米载体包括氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)、碳量子点(Carbon quantum dot, CQDs)、脂质膜包被的二氧化硅-碳杂合纳米颗粒(Lipid membrane-coated silica-carbon, LSC)等等.下面将对一些实例进行分类讨论.

2.3.1 氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)具有稳定性高、比表面积较大、尺寸适中的良好特性，且能通过π-π堆积和疏水相互作用与药物进行结合.经过生物相容涂层修饰的氧化石墨烯具有良好的生物相容性[40].Zhang及其团队制备了甘草次酸(Glycyrrhetinic acid, GA)官能化的氧化石墨烯(GA-GO)纳米载体[41].甘草次酸本身在几种癌症中具有抗肿瘤活性，且同时具有肿瘤和线粒体双重靶向功能，因此该作者选择GA作为肿瘤靶向配体和线粒体靶向配体.负载Dox的GA-GO在HepG2细胞中具有比游离Dox高两倍的细胞毒性.生物分布研究发现其在荷瘤小鼠的肝脏中亦有较多累积，但血液化学筛选试验发现在开始治疗后21 d，负载Dox的该纳米微粒没有引起明显的肝脏或全身毒性.

Wei及其团队制备了αvβ3单克隆抗体-氧化石墨烯-焦脱镁叶绿酸-a复合物，该复合物能有效靶向αvβ3阳性肿瘤细胞，通过光敏剂焦脱镁叶绿酸-a产生光毒性，并通过线粒体膜电位和极化GO之间的电子反应靶向线粒体[42].该复合物具有基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的光毒性开/关切换功能.在血液与细胞质等水性环境中光毒性关闭，在靶向线粒体、位于脂质膜系统中时光毒性开启，以减少副作用，增大药物负荷.细胞毒性检测显示，GO-光敏剂复合物具有最小的暗毒性；在αvβ3阴性的MCF-7细胞中，相对游离焦脱镁叶绿酸-a，该复合物的光毒性减小，这可能是因为分子尺寸的增大降低了纳米药物的内吞作用；但在αvβ3阳性的U87-MG细胞中，该复合物在光照条件下对细胞的抑制作用达到游离焦脱镁叶绿酸-a的7倍左右，这可以归因于药物装载和转运效率的提高和αvβ3单克隆抗体与GO提供的αvβ3阳性肿瘤细胞/线粒体靶向作用.

2.3.2 碳量子点(Carbon quantum dot, CQDs) 因为具有强大而稳定的荧光和极低的细胞毒性，碳量子点已在生物成像，生物标记和生物传感等领域被用作荧光探针[43]. Ye及其团队用CQD和TPGS-TPP制备纳米胶束，将其用于线粒体靶向递送Dox[44].与游离Dox相比，装载Dox的CQD纳米胶束在耐药性MCF7细胞中具有低五倍的IC50值.

2.3.3 脂质膜包被的二氧化硅-碳杂合纳米颗粒(Lipid membrane-coated silica-carbon, LSC)Wang及其团队合成了直径约45 nm的脂膜包被的二氧化硅-碳杂合纳米颗粒(Lipid membrane-coated silica-carbon, LSC)[45].线粒体外表面存在将丙酮酸主动转运到线粒体中的单羧酸转运蛋白(Monocarboxylate transporters, MCTs)，而葡萄糖水热法合成的胶体碳球纳米颗粒(colloidal carbon sphere, CCS)表面有与丙酮酸结构相似的丙酮醛基团，因此CCS能特异性靶向线粒体.以原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)进行处理以缩小纳米颗粒的尺寸，再用3-氨丙基三甲氧基硅烷 ((3-Aminopropyl) trimethoxysilane, APTMS)处理其表面以吸收二棕榈酰磷脂酰胆碱(phospholipid dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)形成脂质包被，以提升其生物相容性.最终得到了稳定的LSC纳米颗粒.装载Dox的该纳米颗粒线粒体靶向能力良好，且对多药耐药细胞具有理想的光毒性.在游离Dox和未装载Dox的LSC纳米颗粒几乎不能对NCI/RES-ADR多药耐药癌细胞造成抑制的情况下，在近红外光照射下装载Dox的LSC纳米颗粒使NCI/RES-ADR多药耐药癌细胞几乎全部死亡.其机制为LSC纳米颗粒靶向积累在线粒体中，并在NIR照射下产生ROS，氧化NADH、抑制ATP的产生.经LSC 和近红外光照治疗后NCI/RES-ADR多药耐药癌细胞的P-gp转运蛋白表达降低，失去其耐多药能力至少5 d.

2.4 用纳米颗粒负载线粒体靶向药物

前文已经提到，线粒体靶向配体-药物缀合物通常具有水溶性差和具细胞毒性等缺点，因此它们难以被应用于临床研究.一种解决方案是利用纳米载体递释系统将其递送到肿瘤部位，随后将其释放，药物利用其缀合的线粒体靶向配体到达线粒体.下面简要介绍一些基于这种思路的研究实例.

Battogtokh G及其团队将抗癌药物多西紫杉醇(Docetaxel, DTX)与4-羧基丁基三苯基膦缀合以增强其线粒体靶向能力，再将TPP-DTX缀合物加载到叶酸-胆固醇基白蛋白(FA-chol-BSA)纳米颗粒中以改善其生物相容性.[46]体外研究表明该纳米颗粒具有良好的线粒体靶向性，经该纳米颗粒孵育60 min的MCF-7细胞的线粒体TPP-DTX的浓度是经游离DTX处理的细胞线粒体中DTX浓度的5.3倍.产生ROS介导细胞凋亡，孵育12 h后该纳米颗粒对B16F10细胞展现出较游离DTX高3.9倍的细胞毒性.该纳米颗粒对MCF-7细胞荷瘤小鼠的肿瘤生长产生抑制效果，给药21天后，荷瘤小鼠肿瘤体积是游离DTX处理组的大约二分之一.且该纳米颗粒的治疗指数为69.5%，显著高于游离DTX(24%)和游离TPP-DTX(45.5%).这说明该纳米颗粒提高了抗癌药物的安全性.

上述团队亦将线粒体靶向光敏剂三苯基膦脱镁叶绿酸a(Triphenylphosphonium-pheophorbide-a, TPP-PhA)加载到叶酸-胆固醇-牛血清白蛋白(Folate-cholesteryl-albumin, FA-chol-BSA)纳米颗粒中(表示为TPP-PheoA@FA-chol-BSA 纳米颗粒)，以增强TPP-PhA缀合物的水溶性和生物相容性[47].该载药纳米颗粒主要在线粒体中积累，较游离PhA和装载PhA的FA-chol-BSA纳米颗粒(表示为PheoA@FA-chol-BSA纳米颗粒)光毒性均增强.体内研究表明其肿瘤靶向性良好，对肿瘤生长的抑制作用高于游离PhA和PheoA@FA-chol-BSA纳米颗粒.且TPP-PheoA@FA-chol-BSA 纳米颗粒具有最高的治疗指数(82.9%)，高于游离脱镁叶绿酸a(30%)和PhA@FA-chol-BSA纳米颗粒(45%).

Song及其团队开发了一种pH敏感性胶束[13].将1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dimethylaminopyridine, DSPE)用腙键与聚乙二醇相连，该腙键在较低pH下断裂，因此胶束能够在溶酶体和内体中解体，从而使药物在短时间内大量释放，这将有助于克服P-gp转运蛋白介导的癌细胞多药耐药性.在该DSPE-hyd-PEG缀合物上附着茴香酰胺(anisamide, AA)以提高对癌细胞的靶向性，最终制成DSPE-hyd-PEG-AA胶束.Dox和DQA-Dox被装载在该胶束中.细胞摄取和亚细胞分布研究表明该胶束可将Dox和DQA-Dox分别传递至细胞核和线粒体.体外细胞毒性实验中，相同剂量下该载药胶束对MDA-MB-231/ADR细胞(对Dox耐药)显示出比游离Dox高近10倍的细胞毒性.在Dox抗性肿瘤模型中，装载有Dox的胶束具有比游离Dox更强的抗肿瘤活性，相同剂量处理22 d，肿瘤体积比游离Dox处理小大约7倍.相比游离Dox，该胶束亦对正常器官具有更小的毒性.

3 结论

迄今为止，已经有很多抗癌药物线粒体靶向递送的相关研究.早期有许多研究基于线粒体靶向配体和抗癌药物直接缀合的思路，合成了一系列线粒体靶向抗癌药物缀合物.这些缀合物表现出比游离抗癌药物更高的抗癌能力，但它们亦存在水溶性差、具有细胞毒性等缺陷.而使用线粒体靶向纳米载体具有相对游离药物更高的抗癌效果、更好的生物相容性、更长的血液循环时间和在指定靶位裂解释药等等优点.一种新的思路即用纳米载体递释系统装载线粒体靶向抗癌药物缀合物，这亦一定程度上克服后者的缺陷.无论是缀合物还是纳米载体都在解决肿瘤耐药性方面有一定成果.未来纳米载体递释系统可能会成为线粒体靶向抗癌药物递送研究的重要方向，期待未来更多性能优越且具有巨大临床应用潜力的线粒体靶向纳米载体研究涌现.